[Study on the expression of TRIP13 mRNA in chronic lymphocytic leukemia B lymphocyte and the molecular mechanism of TRIP13 mediated JVM-2 cell proliferation and apoptosis].

Objective: To investigate the clinical significance of expression level of thyroid hormone receptor interactors 13 (TRIP13) gene to probe its function and downstream molecular mechanism in chronic lymphocytic leukemia (CLL) .
Methods: Real-time quantitative PCR method was used to detect the expression levels of TRIP13 mRNA of CD19(+) B lymphocytes in 30 cases of patients with CLL and 12 cases of peripheral blood hematopoietic stem cell donors (normal control group) . Lentivirus mediated shRNA was used to interference the mRNA and TRIP13 protein in CLL cells JVM-2. Scramble sequence was used as control. Methyl thiazolyl tetrazolium colorimetric assay (MTT) and flow cytometry was used to detect the cell proliferation and apoptosis in TRIP13 knocked-down and negative control JVM-2 cells.
Results: TRIP13 mRNA level was significantly higher in 30 cases of CLL patients (2(-△Ct)= 0.014 89) compared with 12 healthy donors (2(-△Ct)= 0.000 19) (P<0.001) . Validated TRIP13 shRNA target was achieved in JVM2 cell. Compared with the control group, down-regulation of TRIP13 expression could significantly inhibit the proliferation of JVM-2 cells and induce apoptosis. The expressions of Myc and Bcl-2 protein in JVM-2 cells decreased significantly after interference with TRIP13 (P<0.001) , and the expressions of Bax, caspase 3 and Bad protein increased significantly (P<0.001) .
Conclusion: TRIP13 mRNA significantly over-expressed in CLL patients CD19(+) B lymphocytes. TRIP13 could influence JVM2 cell proliferation and apoptosis through proliferation- and apoptosis-related proteins.

甲状腺激素受体相互作用分子13（thyroid hormone receptor interactor 13，TRIP13）是最早在小鼠中发现的一种有丝分裂检查点相关蛋白（pachytene checkpoint 2），是一种AAA+ ATP酶，在小鼠、酵母及线虫细胞中主要发挥细胞周期检查点的功能[1]–[4]。近年来TRIP13和人类肿瘤的关系正在引起关注。TRIP13能够促进头颈部肿瘤细胞DNA损伤修复，从而介导肿瘤细胞对化疗及放疗耐受[5]。联合分析TRIP13和前列腺特异性抗原（PSA）表达可以更精确地诊断前列腺癌[6]。此外，在非小细胞肺癌中TRIP13基因DNA拷贝数发生了明显改变[7]。本研究中，我们应用实时荧光定量PCR检测慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血CD19+ B淋巴细胞TRIP13 mRNA的表达水平，从细胞水平探讨TRIP13干扰对CLL细胞系JVM-2增殖和凋亡的调控作用及其分子机制。

材料与方法

1．标本来源及制备：本研究纳入2014年3月1日至2015年10月31日期间河南省肿瘤医院收治的30例初诊CLL患者。男18例，女12例，中位年龄61（52~79）岁，外周血中位WBC 78.64（31.93~252.46）×109/L，中位淋巴细胞比例0.76（0.56~0.98）。以12名造血干细胞供者作为正常对照组。采集CLL患者及正常对照组外周血标本，常规分离单个核细胞并应用CD19磁珠（德国美天旎公司产品）分选CD19+ B淋巴细胞。本研究经医院伦理委员会审核批准，受试者均知情同意。

2．细胞株：B细胞来源CLL细胞系JVM-2购自American Type Culture Collection细胞库，使用含10%胎牛血清的DMEM培养基（美国Gibco公司产品），在37 °C、5% CO2、相对湿度95%条件下培养。

3．实时荧光定量PCR检测外周血B淋巴细胞TRIP13 mRNA表达：反应体系参照SYBR® Premix Ex Taq™ Ⅱ试剂盒（日本TaKaRa公司产品）说明书配制。反应条件：95 °C 10 s，95 °C 5 s，60 °C 30 s（39个循环）。CLL患者和正常对照组外周血B淋巴细胞TRIP13 mRNA相对表达量用2−ΔCt法表示。

4．Western blot法检测蛋白表达：用细胞蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，行SDS-PAGE分离蛋白（90 V 30 min，120 V 1 h）。电泳结束后以电转移法将蛋白从凝胶转移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，用5% BSA液封闭，依据膜面积计算抗体体积，分别加入TRIP13、Bcl-2、Myc、GAPDH（英国Abcam公司产品，1∶1 000）室温孵育1 h，然后再加入1∶10 000对应二抗（美国Santa Cruz公司产品）室温孵育1 h，最后将PVDF膜用ECL化学发光试剂盒（美国GE公司产品）处理并显影。蛋白表达使用化学发光法检测并通过G:BOX化学凝胶成像系统（美国Syngene公司产品）检测。实验重复3次。

5．SiRNA慢病毒载体构建及感染：TRIP13干扰慢病毒载体GV115由上海吉凯基因化学技术有限公司构建。培养生长状态良好的目的细胞，使用MOI=50进行正式感染。参照预实验确定的感染时间点，于荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白（EGFP）表达情况，感染率达70%~80%、细胞汇合度达80%时收集细胞进入后续实验。TRIP13的所有使用靶点分别为：5′-GAAGACATAAACCTGAGTGTT-3′，5′-GACATAAACCTGAGTGTTAGA-3′和5′-TACTCAACAGACATAATAT-3′。有效干扰靶点序列为5′-TACTCAACAGACATAATAT-3′，对照序列为5′-GCCTAACTGTGTCAGAAGGAA-3′。

6．MTT比色法检测JVM-2细胞增殖能力：取对数生长期JVM-2细胞，使用TRIP13干扰对照慢病毒感染后接种于96孔板（每孔200 µl），分别培养1、2、3、4、5 d后加入5 mg/ml MTT 20 µl，继续培养4 h，弃上清，每孔加入150 µl DMSO，振荡10~20 min充分溶解结晶后，用酶标仪于490 nm测定每孔的吸光度（A）值。实验重复3次。

7．流式细胞术检测JVM-2细胞凋亡：用冷PBS缓冲液洗涤JVM-2细胞2次，3 000 r/min离心2 min（离心半径8 cm），弃上清，加入490 µl预冷结合缓冲液重悬细胞（细胞密度为1×105/ml~1×106/ml），再加入5 µl Annexin Ⅴ-APC和5 µl PI于细胞悬浮液中，轻轻混匀并将试管置于冰上，避光培养10 min，上机检测。

8．统计学处理：采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行数据分析，计量资料均用单样本K-S法进行正态性检验且符合正态分布，采用±s表示，多组间与组内多指标比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验，非成对样本比较采用U检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．实时荧光定量PCR检测CLL患者外周血B细胞TRIP13 mRNA表达：30例CLL患者B细胞TRIP13基因mRNA的表达（2−ΔCt=0.014 89）高于正常对照组（2−ΔCt=0.000 19）（P<0.001），提示TRIP13高表达可能和CLL的发病相关。

2．JVM-2细胞有效TRIP13干扰靶点的筛选：使用对照慢病毒摸索JVM-2细胞的感染条件，为了确定慢病毒的感染效率，所有使用的慢病毒载体均携带EGFP。如图1所示，荧光显微镜下在MOI=50时JVM-2细胞的感染率>90%，适合进行后续实验。

图1

JVM-2细胞的慢病毒感染效率

A：绿色荧光通道；B：白光通道

针对人源TRIP13的CDS区域序列寻找适合的siRNA干扰靶点作用区域。一共设计了3条siRNA序列：5′-GAAGACATAAACCTGAGTGTT-3′、5′-GACATAAACCTGAGTGTTAGA-3′和5′-TACTCAACAGACATAATAT-3′。分别标记为干扰1、干扰2、干扰3。通过Western blot实验发现，3个靶点在JVM-2细胞中都能够一定程度地下调TRIP13的蛋白表达，且3号干扰靶点在JVM-2细胞中的蛋白敲减效率最高（图2），因此选择3号靶点进入后续实验。

图2

TRIP13的3个干扰靶点在JVM-2细胞中的蛋白水平敲减效率比较

1：对照组；2~4分别为干扰1、2、3

3．MTT比色法检测TRIP13干扰对JVM-2细胞增殖的影响：使用最佳干扰靶点处理JVM-2细胞后应用MTT比色法检测TRIP13干扰病毒及对照病毒感染5 d内两组细胞的增殖活性，结果显示，TRIP13干扰慢病毒感染后JVM-2细胞的增殖活性较对照组显著下降（P<0.05）（图3）。

图3

MTT比色法检测TRIP13干扰对JVM-2细胞增殖的影响（n=3；aP<0.01；bP<0.001）

4．流式细胞术检测TRIP13对JVM-2细胞凋亡的影响：由于慢病毒载体携带EGFP标签，因此使用Annexin Ⅴ-APC单染方法进行凋亡检测，以去除可能的EGFP荧光干扰实验结果。TRIP13干扰组JVM-2细胞凋亡率高于对照组[8.78±0.42）%对（4.95±0.69）%，t=9.730，P<0.001]，提示慢病毒介导的TRIP13干扰可能通过影响细胞凋亡来调控JVM-2细胞增殖。

5．Western blot检测TRIP13干扰对JVM-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响：干扰TRIP13后JVM-2细胞中Bcl-2和Myc蛋白表达下调（P<0.001），Bax、caspase3和Bad蛋白表达上调（P<0.001），详见图4。提示TRIP13能够通过调控Myc和Bcl-2家族蛋白导致JVM-2细胞产生caspase3依赖性的细胞凋亡以及细胞增殖抑制。

图4

Western blot法检测TRIP13干扰对JVM-2细胞凋亡相关蛋白表达的影响

讨论

CLL是一种老年性疾病，以免疫功能不全的高分化淋巴细胞克隆性增殖为主要特征。针对CLL的新的治疗方法特别是药物作用靶点是目前研究的热点。

TRIP13基因已被证明是一个着丝粒定位蛋白，其功能为确保细胞分裂准确进行。许多着丝粒定位蛋白在多种肿瘤中高表达，其表达量与基因组不稳定或肿瘤细胞恶性转化相关[8]–[11]。本研究首次发现CLL患者TRIP13基因mRNA表达高于正常人，提示TRIP13的异常高表达可能与CLL的发生发展有关。TRIP13的高表达也存在于头颈部肿瘤和前列腺癌中，表明TRIP13可在多种肿瘤中高表达，与其他着丝粒定位蛋白类似。因此，TRIP13可能是一种广谱的原癌基因[12]–[14]。

有丝分裂异常往往导致非整倍体细胞的产生，促进细胞的遗传不稳定性和诱导细胞凋亡或恶性转化。有丝分裂需要确保着丝粒正确连接到纺锤体介导的染色体精确分布。该过程需要一个关键的蛋白复合物——有丝分裂检查点复合物（MCC），其中包含有丝分裂纺锤体检查点蛋白1（MAD1）和MAD2形成的二聚物。异常表达或功能失活的MCC和多种肿瘤的发生发展相关。MAD2或MAD1的杂合性缺失会导致小鼠的胚胎成纤维细胞出现高频率的非整倍体。这些结果表明，该复合体在肿瘤形成中发挥重要的作用[15]–[18]。TRIP13具有促进MCC复合体解离并抑制有丝分裂完成的作用。因此，异常高表达的TRIP13和缺失的MCC复合体具有类似的促癌作用，因为两者都可以导致有丝分裂的异常并产生非整倍体细胞。

本研究应用慢病毒介导的shRNA干扰JVM-2细胞TRIP13表达，并应用MTT比色法和流式细胞术检测TRIP13干扰前后JVM-2细胞的增殖和凋亡情况，证明了TRIP13在调控JVM-2细胞增殖和凋亡过程中所起的作用，其调控JVM-2细胞增殖凋亡的分子机制包括Myc、Bcl-2等多个信号通路。在这项研究中，我们发现了新的TRIP13促进B细胞恶性转化的机制。TRIP13干扰能够诱导Myc、Bcl-2表达下调，推测TRIP13可能通过转录调控直接影响下游各凋亡调控基因来影响CLL细胞的增殖和凋亡。深入研究TRIP13在CLL发生发展中的确切作用机制，可为TRIP13基因成为潜在的CLL药物作用靶点奠定理论基础。