[Effect of TSC2 gene expression downregulation by lentivirus induced RNA interference on U937 cell line and its mechanism].

Objective: To investigate the effect of biology and mTOR pathway activity of down-regulated TSC2 gene expression on U937 leukemia cells.
Methods: Gene expression was down-regulated by lentivirus induced RNA interference on TSC2 high expressed U937 cell line; the proliferation, apoptosis and differentiation were detected by CCK-8 assay, colony formation assay and flow cytometry; the gene expression level and protein kinase activity were detected by qRT-PCR and Western blot.
Results: Down-regulated expression of TSC2 gene promoted U937 cell proliferation and colony formation ability (P<0.05) . The proportion in G(0)/G(1) phase of TSC2 down-regulated U937 cell was much lower than that of the control cells [ (52.53±3.75) % vs (75.10±4.33) %, t=6.829, P=0.002], the S phase [ (22.43±1.00) % vs (15.47±1.20) %, t=-5.581, P=0.019] and G(2)/M phase [ (25.03±4.34) % vs (14.33±0.91) %, t=-5.413, P=0.013] was remarkably higher than that of the control cells (P<0.05) . There were no statistically significant differences in cell apoptosis and differentiation (P>0.05) . Down-regulation of TSC2 led to the increased activity of mTOR, 4EBP1 and S6K1, but did not influence the activity of AKT. The expressions of proliferation related cyclinD1, c-myc and PTEN were also up-regulated after TSC2 silenced, but the expressions of P27KIP and BCL-XL were not changed.
Conclusion: Downregulation of TSC2 could promote the proliferation of U937 cells through up-regulation of mTOR activity.

信号转导通路的组成性激活能够增强急性白血病（AL）细胞的存活和增殖能力。TSC2-mTOR信号通路在控制细胞生长、增殖、存活和分化中有着重要的功能，其活化过程通过不同的上游信号机制调节，但最终聚焦于TSC1/TSC2复合体，通过发挥TSC2的GTP酶活化蛋白（GTPase-activating protein，GAP）活性抑制小G蛋白Rheb（Ras homologue enriched in brain）进而抑制哺乳动物雷帕霉素靶分子（mammalian target of rapamycin，mTOR）的活性[1]。有研究表明在AL细胞中mTOR常常被过度激活[2]–[3]，而我们在前期研究中发现，TSC2基因在部分AL患者中表达降低[4]。由此提出假设：在AL细胞中，TSC2低表达与mTOR的异常激活及白血病的发生有关。本研究中我们通过构建慢病毒质粒，研究TSC2表达下调对白血病U937细胞的生物学作用及可能机制。

材料与方法

1．材料和试剂：U937细胞株由中国医学科学院血液学研究所馈增，RPMI 1640培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，pLVX干扰慢病毒由杭州百恩维公司构建包装。RNA提取试剂盒购自美国Invitrogen公司。PrimeScript RT Master Mix逆转录试剂盒、SYBR Green Mix购自大连TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；CCK-8试剂盒购自日本同仁化工公司；碘化丙锭（PI）购自上海碧云天生物技术有限公司；甲基纤维素为Stem Cell公司产品；AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染凋亡试剂盒购自美国BD公司；CD11b、CD15、CD13、CD33、CD14和CD64抗体购自美国Beckman公司；抗mTOR、4EBP1、70S6K1、AKT、磷酸化（p）-mTOR、p-70S6K、p-P70S6K、p-AKT一抗购自美国Cell Signaling公司，抗TSC2、β-actin一抗、二抗及Western blot化学发光工作液均购自美国Santa Cruz公司；嘌呤霉素（Puromycin, Puro）购自美国Sigma公司。

2．细胞培养：人白血病细胞系U937细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37 °C、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。

3．pLVX-ShRNA慢病毒的包装及U937细胞的感染：根据TSC2 cDNA序列设计4条ShRNA引物，由美国Invitrogen公司合成，构建质粒载体pLVX-ShRNA-Puro，将4条质粒通过Polyfectin转染试剂盒瞬时转染TSC2高表达的MCF7细胞，荧光定量PCR测定4条ShRNA的干扰效率，选择干扰效率最好的重组质粒pLVX-ShRNA2-Puro-hTSC2-4（干扰效率为80%）序列为：上游引物：5′-GATCCGCCAC ACACACCACTTCAACATTCAAGAGATGTTGAA GTGGTGTGTGTGGCTTTTTTCTCGAGG-3′；下游引物：5′-AATTCCTCGAGAAAAAAGCCACACA CACCACTTCAACATCTCTTGAATGTTGAAGTG GTGTGTGTGGCG-3′。转染293T细胞进行慢病毒包装。慢病毒感染HEK293测得ShRNA2-Puro-hTSC2-4滴度为2×108 TU/ml；对照质粒ShRNA2-Puro-hScramble滴度为2×108 TU/ml。将−80 °C冻存的病毒液冰上融化，感染U937细胞，48 h后，流式细胞术测定绿色荧光蛋白（GFP）荧光表达，嘌呤霉素1 µg/ml筛选阳性细胞。

4．实时荧光定量PCR检测mRNA表达：TRIzol提取细胞总RNA，取1 µg RNA逆转录为cDNA，按照SYBR Green PCR试剂盒说明进行PCR扩增，条件：90 °C预变性10 s，随后90 °C变性5 s，60 °C延伸40 s，共40个循环。ABI 7300检测荧光信号。利用公式RQ=2−ΔΔCt计算相对表达量。每组均设3个重复孔，实验重复3次。每次PCR后均进行熔解曲线分析以确认扩增产物的特异性（引物序列见表1）。

表1

实时荧光定量PCR的引物序列

基因	引物序列（5′→3′）
TSC2	F：GGCAAGAGAGTAGAGAGGGACG
	R：AAGAAGGGGGAATGGTAGAGC
PTEN	F：ATACCAGGACCAGAGGAAACC
	R：TTGTCATTATCCGCACGCTC
cyclin D1	F：GATCAAGTGACCCGGACTG
	R：CAAGCCAGGTCCACCTCCTC
P27kip1	F：CTGCAACCGACGATTCTTCTACT
	R：GGGCGTCTGCTCCACAGA
c-myc	F：GCGACTCTGAGGAGGAACA
	R：TGAGGACCAGTGGGCTGT
BCL-XL	R：CATGGCAGCAGTAAAGCAAG
	R：GCATTGTTCCCATAGAGTTCC
GAPDH	R：GAAGGTGAAGGTCGGAGTC
	R：GAAGATGGTGATGGGATTTC

注：F：正向引物；R：反向引物

5．Western blot法检测蛋白表达水平：分别取1×106细胞，PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，枪尖反复吹吸充分裂解细胞，冰上放置30 min；12 000 r/min离心5 min，吸取上清；BCA法进行蛋白定量；聚丙烯酰胺凝胶电泳及PVDF膜半干转，1∶2 000稀释兔抗人TSC2单克隆抗体溶液中，室温孵育2 h；洗涤后1∶2 000稀释的HRP标记羊抗兔IgG溶液中室温孵育1 h；洗涤后化学发光显色。TSC2蛋白以β-actin为内参照。同时检测mTOR、P70S6K、4EBP1、AKT的磷酸化状态反映mTOR通路活性状态，以非磷酸化抗体检测总蛋白的表达作为对照。

6．CCK-8法检测细胞增殖活性：将感染后的U937细胞按3×104/孔接种于96孔板，参照CCK-8试剂盒说明进行操作。细胞培养24 h后，每孔加入10 µl的CCK-8继续孵育3 h，用酶标仪在波长450 nm、参比波长620 nm的条件下测定各孔的吸光度（A）值，实验重复3次。

7．集落形成能力分析：接种感染后的U937细胞于24孔板（500细胞/孔），加入含0.9%甲基纤维素的完全培养基2 ml，于37 °C、5% CO2、饱和湿度条件下常规培养，第14天记录细胞集落形成数，大于50个细胞者为1个集落。每组设3个复孔，实验重复3次。

8．流式细胞术检测细胞周期及凋亡：采用PI标记，检测G0/G1、S、G2/M各期细胞比例；采用抗髓系分化抗原抗体包括CD13、CD33、CD11b、CD15、CD14和CD64标记，流式细胞术检测细胞分化；采用AnnexinⅤ-PE/7-AAD双染色流式细胞术检测细胞凋亡。实验重复3次。

9．统计学处理：采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示，对计量资料先进行正态性检验，呈正态分布的计量资料采用t检验；不符合正态分布的计量资料，通过自然对数法进行转换，使其符合正态分布后，再采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

一、慢病毒感染U937细胞后TSC2基因mRNA和蛋白的表达

慢病毒感染U937细胞48 h后，流式细胞术检测GFP表达，空载体对照组和干扰组GFP阳性率分别为25.0%和17.0%，经嘌呤霉素（1 µg/ml）筛选7 d后，流式细胞术检测GFP表达，空载体对照组和干扰组GFP阳性率分别达85.3%和70.2%。采用实时定量PCR方法检测TSC2 mRNA的表达，干扰效率为71.7%。Western blot法检测蛋白表达，可见表达量明显下调（图1）。

图1

Western blot检测慢病毒感染后U937细胞TSC2蛋白表达水平

1：未感染组；2：空载体对照组；3：TSC2干扰组

二、下调TSC2基因表达对U937细胞的生物学作用

1．细胞增殖：CCK-8细胞增殖实验结果表明，培养24 h，TSC2基因表达下调后，细胞增殖活性增强。与未感染组细胞相比，干扰组细胞增殖活性增强了（5.15±0.72）倍，空载体对照组细胞增殖活性增强了（1.92±0.63）倍，干扰组与空载体对照组之间差异具有统计学意义（t=−16.644, P<0.001）。

2．集落形成：集落形成能力实验表明，培养14 d后，与空载体对照组（91±4）相比，干扰组的细胞集落形成能力明显增强（158±12），二组之间差异具有统计学意义（t=−8.510, P=0.001）（图2）。

图2

细胞集落形成实验

3．细胞周期：培养24 h后，与空载体对照组相比，干扰组细胞G0/G1期细胞比例明显降低（t=6.829, P=0.002），S期细胞比例增高（t=−5.581, P=0.019），G2/M期细胞比例增高（t=−5.413, P=0.013）（表2）。

表2

流式细胞术检测TSC2基因表达下调对U937细胞周期的影响（%，±s）

组别	G0/G1期	S期	G2/M期
空载体对照组	75.10±4.33	15.47±1.20	14.33±0.91
TSC2干扰组	52.53±3.75	22.43±1.00	25.03±4.34
t值	6.829	−5.581	−5.413
P值	0.002	0.019	0.013

注：实验重复3次

4．细胞分化：经流式细胞术检测，细胞培养24 h后，与空载体对照组相比，干扰组细胞CD13、CD33、CD11b、CD15、CD14、CD64表达差异均无统计学意义（P值均>0.05）（表3）。

表3

流式细胞术检测TSC2基因表达下调对U937细胞分化的影响（%，±s）

组别	CD13	CD33	CD11b	CD15	CD14	CD64
空载体对照组	97.90±2.54	95.90±1.65	5.40±1.31	72.50±4.50	2.87±0.21	33.76±5.71
TSC2干扰组	98.40±1.16	95.40±1.12	7.40±0.85	66.00±3.36	2.40±1.05	25.17±5.84
t值	−0.290	0.376	−2.213	4.955	0.753	−9.705
P值	0.786	0.726	0.091	0.088	0.494	0.071

注：实验重复3次

5．细胞凋亡：经流式细胞术检测，细胞培养24 h后，TSC2干扰组和空载体对照组U937细胞的凋亡率分别为（24.37±3.07）%和（30.43±6.11）%，二者之间的差异无统计学意义（t=3.640, P=0.053）。

三、TSC2基因表达下调对mTOR通路蛋白的影响

Western blot方法检测结果显示，TSC2表达下调后，mTOR总蛋白未见明显变化，而p-mTOR（Ser2448）表达升高；底物激酶P70S6K和4EBP1总蛋白未见明显变化，但是活性形式p-P70S6K（Thr389）和p-4EBP1（Thr37/46）的表达明显升高；AKT总蛋白及磷酸化蛋白p-AKT（Ser473）的表达均没有明显变化（图3）。实时荧光定量PCR结果表明，TSC2表达下调后，PTEN、cyclin D1、c-myc表达量明显升高；P27kip1、BCL-XL表达量没有明显变化（图4）。

图3

Western bolt检测慢病毒感染对U937细胞信号通路的影响

1：空载体对照组；2：TSC2干扰组

图4

实时荧光定量PCR检测慢病毒感染对U937细胞信号通路的影响（设3个重复孔，实验重复3次）

讨论

TSC基因因在结节性硬化综合征（tuberous sclerosis complex，TSC）中发现突变而备受关注，包括TSC1和TSC2，在细胞内形成异二聚体（TSCI/TSC2复合物）后，通过发挥TSC2的GAP活性抑制小G蛋白Rheb进而抑制mTOR的活性。因此，正常情况下，TSC2通过作用于Rheb负性调控mTOR的蛋白激酶活性。激活的mTOR可导致蛋白翻译的关键调节因子S6K1和4EBP1的磷酸化，磷酸化的S6K1和4EBP1能够促进细胞生长的关键蛋白的翻译，如cyclinD1、c-Myc、BCL-XL、P27KIP、Rb蛋白、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、NF-κB、STAT3、CLIP-170等[5]–[8]。因此，异常激活的mTOR可以引起肿瘤细胞的快速增殖、加快细胞周期、促进细胞侵袭和转移，在恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用。

研究发现，在AL细胞中，mTOR激酶被异常激活，通过mTOR抑制剂雷帕霉素抑制mTOR活性，可以使细胞周期阻滞在G0/G1期，抑制AL中大多数幼稚细胞的生长，而对正常造血祖细胞无明显影响。mTOR的两个下游靶基因S6K1和4EBP1在AL细胞中也以雷帕霉素敏感的方式被组成性磷酸化[2],[9]。TSC2基因的表达异常在人类多种肿瘤中存在，Jiang等[10]发现TSC2基因在人类乳腺癌表达降低，并且与肿瘤细胞的扩散和临床预后有关。Kataoka等[11]发现TSC2基因表达下调与前列腺癌的发生有关。Sales等[12]发现TSC2在子宫内膜癌组织中较正常子宫内膜组织表达下调。Cao等[13]在黑色素瘤细胞系中，证明下调TSC2的表达能够异常活化mTOR，进而激活下游通路蛋白。Cho等[14]分析了肝细胞癌中TSC2基因的表达情况，结果表明33.3%（12/36）的患者显示TSC2低表达或缺失表达，且TSC2低表达的患者或者肝癌细胞系对于mTOR抑制剂everolimuss具有更好反应性或敏感性。我们前期研究发现TSC2基因在部分AL患者中表达下调，结合AL细胞中mTOR常常被过度激活，推断TSC2低表达可能与mTOR的异常激活及白血病的发生有关[4]。本研究我们通过慢病毒介导的TSC2表达下调，研究了TSC2-mTOR信号通路在U937细胞中的作用及可能机制。

我们选择TSC2高表达的U937细胞，体外研究降低TSC2基因表达对U937细胞增殖、分化及凋亡的影响,以及对mTOR通路蛋白激酶活性的影响。结果表明TSC2表达降低能够促进U937细胞的增殖和集落形成能力；能够使U937细胞G0/G1期比例明显降低，G2/M期、S期比例升高，但是对细胞分化和细胞凋亡没有明显的影响。通路蛋白活性实验表明，TSC2基因表达下调后，mTOR活性升高，磷酸化的4EBP1和S6K1活性升高，与细胞增殖相关的基因cyclinD1、P27KIP和c-myc表达升高，PTEN基因表达升高，而AKT蛋白活性和凋亡相关基因BCL-XL的表达没有明显的改变。

目前认为，mTOR信号通路的激活是通过PI3K/Akt途径来实现的。应用PI3K抑制剂沃曼青霉素和mTOR抑制剂雷帕霉素建立了一种信号转导模型，根据这一模型，生长因子通过与其受体结合激活细胞内PI3K，进而激活AKT，活化的AKT磷酸化TSC2，导致TSC1/TSC2复合体解体，使mTOR不再受其抑制而活化[15]。然而，在一些AL细胞中，mTOR的活化并不依赖于PI3K/AKT的激活[16]，我们的研究表明在白血病细胞中，TSC2低表达能够加快细胞周期，促进细胞增殖，且这种作用与mTOR活性升高，进而活化其下游信号分子4EBP1和S6K1及其相关靶基因有关。本研究还表明，TSC2表达降低后PTEN基因表达升高，而AKT的活性没有明显改变。以往研究显示，在TSC2表达缺失的小鼠胚胎成纤维细胞中，通过HIF-1α活性升高促进PTEN基因的表达，同时伴随AKT活性降低[17]。本实验结果说明在TSC2低表达的白血病细胞中mTOR的活性并不依赖于AKT的作用，但是可能与PTEN基因介导的其他通路蛋白的活性有关，具体机制尚需进一步研究。

本实验在前期研究的基础上通过慢病毒介导的基因沉默的方法，探讨了在AL细胞系中TSC2表达下调对白血病细胞系的影响及相关机制，结果表明TSC表达下调可以通过激活mTOR通路蛋白促进细胞增殖，可能与白血病的发生有关，为AL的靶向治疗提供了新的思路。