[A Study on the establishment of immune thrombocytopenia model induced by anti-platelet GPⅠbα antibodies].

Objective: To establish primary immune thrombocytopenia (ITP) animal model induced by anti-platelet membrane glycoprotein GPⅠbα antibodies AN51 and R300.
Methods: Twenty guinea pigs (6-8 week) were divided into 4 groups. Five guinea pigs in each group were intravenously injected with different doses of AN51 (0.05, 0.1, 0.2 μg/g) and 0.2 μg/g IgG as control. The whole blood was collected from inner angular venous plexus. Platelets number was determined by an automated cell counter and Swiss-Jim method. Then, the similar protocol was used to establish ITP nude mice model by intraperitoneal injection of different concentrations of anti-platelet GPⅠbα antibody R300, respectively.
Results: ①Five minutes after intravenous injection of AN51 at 0.05, 0.1 and 0.2 μg/g, the platelet counts of guinea pigs reduced about 0-5%, 50%-60% and 70%-80% compared to the control group, respectively. The difference was statistically significant (P<0.01) . ②Six hours after intraperitoneal injection of R300 at 0.05, 0.1, 0.2 μg/g, the platelet counts of nude mice decreased about 20%-30%, 60%-70% and 80%-90% compared to the control group, respectively. The difference was statistically significant (P<0.01) . The nude mice, injected 0.2 μg/g R300 once a day for 2 weeks, showed typical ITP clinical manifestations including large number of petechiaes or ecchymoses on limbs, head and abdomen.
Conclusion: AN51 at 0.2 μg/g and R300 at 0.2 μg/g could establish stable ITP model in guinea pigs and nude mice respectively.

原发免疫性血小板减少症（ITP）是一种常见的由于自身免疫引起的出血性疾病[1]–[3]。ITP患者体内抗自身血小板抗体多数为抗GPⅡb/Ⅲa型，GPⅠb-Ⅳ型占32.1%[4]–[5]。然而，抗GPⅠb-Ⅳ型抗体的患者多为难治性ITP，常规药物治疗和脾切除的效果不佳[6]–[7]。ITP的发病机制目前还不是十分清楚，其主要是因为机体的免疫系统异常，产生了抗血小板的自身抗体，从而引起自身血小板计数下降[8]。本研究我们使用抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体诱导建立豚鼠和裸鼠ITP模型，旨在为研究ITP发病机制提供理想的动物模型和技术方法。

材料与方法

1．材料：抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体AN51由江苏省血液研究所阮长耿院士惠赠。抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体R300购自德国Emfret公司。豚鼠、裸鼠购自昭衍新药研究有限公司。

2．洗涤血小板：分别采集豚鼠和裸鼠血液2.0、1.0 ml，以葡萄糖柠檬酸钠7∶1抗凝后混匀，200 ×g离心20 min，得到富含血小板血浆（PRP），1 700 ×g离心2 min，弃去上清液，沉淀部分用CGS缓冲液（0.123 mol/L NaCl、0.033 mol/L D-葡萄糖、0.013 mol/L枸橼酸三钠，pH 6.5）重悬，1 700×g离心2 min，弃去上清液，沉淀部分重悬于MTB缓冲液，最后调整血小板悬液的终浓度至3×108/ml。调整Ca2+、Mg2+终浓度为1 mmol/L，室温静置1 h备用。

3．流式细胞术检测抗体与血小板结合：取100 µl 3×108/ml豚鼠或裸鼠血小板悬液，分别加入相对应的终浓度10 µg/ml 2.5 µl IgG（对照组）、1 µl AN51（AN51组）和2 µl R300（R300组）轻轻混匀，室温下孵育30 min，然后加入200 µl CGS缓冲液，1 700×g离心2 min，弃去上清液后分别重悬于50 µl含有抗IgG、AN51和R300二抗（10 µg/ml）的MTB缓冲液，室温孵育30 min，加入350 µl MTB缓冲液上流式细胞仪检测，以CD41-PE和侧向角双参数设定血小板门，FL1 Log荧光通道（488 nm）观测抗体与血小板结合百分率（计数阳性细胞10 000个）。

4．抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体诱导建立ITP动物模型：将20只6~8周豚鼠和裸鼠分别分为对照组和3个实验组，每组5只。豚鼠对照组和实验组分别静脉注射0.2 µg/g IgG和0.05、0.1、0.2 µg/g AN51，裸鼠对照组和实验组分别腹腔注射0.2 µg/g IgG和0.05、0.1、0.2 µg/g R300，在注射后不同时间点对豚鼠和裸鼠行眼眶后静脉丛采血，应用血细胞分析仪检测血小板水平，以此确定建立ITP模型所需要抗体的剂量及时间。

5．统计学处理：采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。所有数据以均数±标准差表示，两组之间的比较采用配对t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

1．AN51诱导建立ITP豚鼠模型：流式细胞术检测显示，AN51能够与豚鼠血小板结合（图1A）。静脉注射0.05、0.1、0.2 µg/g AN51后不同时间点行眼眶后静脉丛采血，血细胞分析结果显示AN51能够以剂量依赖性方式诱导豚鼠外周血血小板计数快速下降，注射后5 min，0.05、0.1、0.2 µg/g AN51组豚鼠血小板计数分别减低0~5%、50%~60%、70%~80%，0.2 µg/g组血小板计数下降最为明显，与对照组（注射0.2 µg/g IgG）比较差异有统计学意义（P<0.001）（图1B）。

图1

抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体AN51诱导建立原发免疫性血小板减少症豚鼠模型

A：流式细胞术检测AN51与豚鼠血小板结合；B：静脉注射AN51后不同时间点血小板水平；aP<0.001，bP<0.01，cP<0.05

2．R300诱导建立ITP裸鼠模型：流式细胞术检测显示，R300能够与裸鼠血小板结合（图2A）。腹腔注射0.05、0.1、0.2 µg/g R300后不同时间点行眼眶后静脉丛采血，血细胞分析结果显示R300能够以剂量依赖性方式诱导豚鼠外周血血小板计数快速下降，注射后6 h，0.05、0.1、0.2 µg/g R300组裸鼠血小板计数分别下降20%~30%、60%~70%、80%~90%，0.2 µg/g组血小板计数下降最为明显，与对照组（注射0.2 µg/g IgG）比较，差异有统计学意义（P<0.001）（图2B）。我们用0.2 µg/g R300建立裸鼠ITP模型，每天注射1次，持续注射1~2周后，裸鼠出现典型ITP出血症状（全身大量瘀点、瘀斑，多见于四肢、头部和腹部）（图3）。

图2

抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体R300诱导建立原发免疫性血小板减少症裸鼠模型

A：流式细胞术检测R300与裸鼠血小板结合；B：腹腔注射R300后不同时间点血小板水平；aP<0.05，bP<0.001

图3

腹腔注射抗血小板膜糖蛋白GPⅠbα抗体R300（0.2 µg/g）诱导建立原发免疫性血小板减少症裸鼠模型

讨论

ITP是一种自身免疫性出血性疾病。其具体发病机制目前尚未阐明，目前主要认为是由于血小板自身抗体致敏的血小板被单核-巨噬细胞系统过度破坏[9]–[10]、自身抗体导致巨核细胞成熟障碍[11]–[12]、细胞毒T细胞溶解血小板[13]–[14]和抗原特异性T细胞免疫失耐受[15]–[18]等原因引起血小板减少。

本课题组既往研究发现抗血小板GPⅠbα氨基端抗体AN51能够诱导血小板GPⅠbα簇集引起的αⅡbβ3依赖的血小板聚集，从而导致血小板被肝脏巨噬细胞所识别，进而在肝脏中被清除[19]。本研究中我们发现AN51能够很好地与豚鼠血小板结合，ITP模型个体之间差异很小，因此很适合用于实验研究。同时，为了建立跟人类ITP更加相似的动物模型，我们还使用抗小鼠血小板抗体R300成功建立ITP裸鼠模型。而且我们还发现，持续注射R300抗体的裸鼠出现了明显的临床出血症状。

综上所述，我们应用0.2 µg/g AN51和0.2 µg/g R300分别成功建立豚鼠、裸鼠ITP模型，其中裸鼠模型表现出明显的ITP临床症状。