[Effects of decitabine on proliferation capacity and TFPI-2 expression in leukemia K562 cells].

近年来研究发现异常的表观遗传学修饰是肿瘤发生的早期事件，基因甲基化修饰改变是血液淋巴系统肿瘤发生的关键步骤之一[1]。组织因子途径抑制物-2（tissue factor pathway inhibitor-2,TFPI-2）是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制物，具有广谱丝氨酸蛋白酶抑制物作用，是一个非常重要的潜在抑癌基因[2]。研究报道，在多种肿瘤中存在TFPI-2基因启动子区域异常甲基化，导致TFPI-2基因表达减低，进而参与肿瘤的发生、发展、侵袭和转移[3]。有研究者在中国儿童急性髓系白血病（AML）患者中发现TFPI-2基因启动子区域存在高频率甲基化，其基因表达水平显著降低[4]–[5]，但该基因在AML疾病发生、发展及预后中的作用及与抗肿瘤化疗药物的靶向作用机制仍不清楚。本研究我们探讨地西他滨治疗AML的分子机制并寻找其新的调控基因。

材料与方法

1．主要试剂与仪器：K562细胞株来自中南大学生命科学学院，购自美国模式培养物保藏所（ATCC）；地西他滨购自正大天晴药业集团股份有限公司；CCK-8试剂盒为Vazyme公司产品；基因组DNA提取试剂盒、小分子量DNA Marker购自生工生物工程（上海）股份有限公司；EZ DNA甲基化试剂盒（Lighting试剂盒）及Zymo Taq酶购自北京天漠科技开发有限公司；β-actin及TFPI-2抗体均为博奥森公司产品；RevertAid(tm) First Strand cDNA Synthesis kit购自赛默飞公司；2×Power Taq PCR MasterMix为北京百泰克生物技术有限公司产品；PCR扩增仪为美国Bio-Rad DNA Engine Peltier Thermal Cycle；流式细胞仪为美国Beckman公司产品。

2．骨髓单个核细胞分离及其TFPI-2基因甲基化水平检测：经患者知情同意后，收集南华大学附属第一医院血液科2014年4月至2015年6月期间33例初诊AML患者骨髓标本，以16例缺铁性贫血（IDA）患者的骨髓标本作为对照组，所有IDA患者均已排除肿瘤因素。取骨髓液2 ml，加入等量PBS混匀，加至淋巴细胞分离液表面，400×g离心20 min后，吸取白色细胞层，PBS洗涤细胞2次，弃上清液，对其进行相应处理后冻存于−80 °C冰箱备用。

基因组DNA提取操作参考生工生物工程（上海）股份有限公司小量柱式基因组DNA提取试剂盒说明书。DNA甲基化修饰参照Zymo公司EZ DNA Methylationg-Lighting Kit操作步骤，回收DNA溶于10 µl M-Elution缓冲液中，储存于−20 °C。TFPI-2甲基化引物（M）及非甲基化引物（U）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。TFPI-2甲基化引物正义链：5′-TTTCGTATAAAGCGGGTATTC-3′，反义链：5′-ACGACCCGCTAAACAAAACG-3′（PCR产物片段95 bp）；TFPI-2非甲基化引物正义链：5′-GGATGTTTGTTTTGTATAAAGTG-3′，反义链：5′-AAACAT CCAAAAAAACACCTAAC-3′（PCR产物片段89 bp）。甲基化扩增体系总体积为25 µl，其中Zymo Taq Premix 15 µl，正、反义引物各2 µl，模板100 ng，剩余体积用双蒸水补齐；反应条件：95 °C预变性10 min，随后94 °C变性30 s，55 °C退火30 s，72 °C延伸30 s，共40个循环，最后72 °C延伸7 min，4 °C维持4 min。用40 g/L琼脂糖凝胶100 V电泳35 min检测扩增产物，紫外灯下观察并摄像。

3．CCK-8法检测细胞存活率：取对数增殖期K562细胞，接种于96孔板中，细胞密度为8×104/ml，每孔100 µl。设3个（2、5、10 µmol/L）地西他滨浓度实验组，并设阴性对照组，每组设4个复孔，共接种4张板，分别培养0、24、48、72 h后在酶标仪上测定450 nm波长下各孔吸光度（A）值，每次检测前2 h分别于每孔加入10 µl CCK-8反应试剂，继续培养2 h，其中0 h板在种板后即加入CCK-8试剂，并放入培养箱培养2 h后检测A值，结果取各重复孔平均数。每次实验重复3次，结果取各重复孔平均值。按以下公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（A实验组−A空白组）/（A对照组−A空白组）×100%。绘制不同浓度地西他滨和不同处理时间后的存活率点线图。使用锥虫蓝染色计数法分别计数0、24、48、72 h各组活细胞数，取其平均值。

4．TFPI-2蛋白表达的检测：不同浓度地西他滨处理K562细胞48 h后收集细胞，PBS洗涤2次，加入RIPA与PMSF混合液（96∶4）200 µl，冰上裂解细胞30 min，4 °C 12 000 r/min（离心半径9 cm）离心5 min，取上清液至0.5 ml离心管中，取上清使用BCA蛋白定量试剂盒测定样品蛋白含量。然后，细胞蛋白提取液与5×蛋白上样缓冲液以4∶1体积比混匀，PCR仪中99 °C加热5 min后离心机短暂离心，然后用提取的蛋白进行SDS-PAGE，100 V恒压电泳2 h，电泳结束后将所需的条带切下，冰上200 mA恒流电转90 min，使分离的条带转移至PVDF膜上，将PVDF膜置于50 g/L脱脂牛奶中室温封闭2 h，加入TFPI-2多克隆抗体后在摇床上室温孵育1 h，然后4 °C过夜，次日TBST漂洗膜10 min，共3次，加入二抗后在摇床上室温孵育1 h，TBST漂洗膜10 min，共3次，采用化学发光法显影。

5．流式细胞术检测细胞周期和凋亡：收集5 µmol/L地西他滨处理48 h的实验组和对照组细胞，用PBS洗涤2次，调整细胞密度，加入5 µl RNAase A，37 °C孵育30 min；再加入125 µl PI染液，4 °C避光孵育30 min，上机检测K562细胞周期参数。此外，加入100 µl结合缓冲液重悬细胞，加入5 µl Annexin V-FITC和5 µl PI，避光，室温下反应10 min，再加入400 µ1结合缓冲液混匀，上机检测K562细胞凋亡情况。

6．统计学处理：数据分析采用SPSS16.0软件进行。实验重复3次，数据采用±s表示。AML与IDA患者骨髓中的甲基化发生率的比较采用卡方检验；CCK-8及细胞计数的均数比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05，方差分析有统计学意义之后的组间两两比较采用LSD法。

结果

1．TFPI-2基因在初治AML患者骨髓中的甲基化情况：甲基化特异性PCR（MS-PCR）检测了33例初诊的AML患者骨髓单个核细胞TFPI-2基因的甲基化情况，结果显示21例（63.6%）患者该基因启动子区域完全甲基化与不完全甲基化阳性（图1），而在16例IDA患者中未检测到该基因甲基化发生。

图1

甲基化特异性PCR检测TFPI-2基因启动子甲基化状态

m：甲基化扩增产物；u：非甲基化扩增产物；M：Marker；1：对照组（缺铁性贫血患者）；2~4：初诊AML患者

2．地西他滨对K562细胞增殖的影响：K562细胞随着地西他滨药物浓度增高，其细胞存活率呈下降趋势（图2），2、5、10 µmol/L浓度组在24、48、72 h各时间点与对照组相比差异均有统计学意义（P值均<0.001），此外，在24、48、72 h各组间细胞存活率差异有统计学意义（F值分别为24.056、99.484、104.089，P值均<0.001）。

图2

CCK-8检测不同浓度地西他滨处理K562细胞的存活率

锥虫蓝计数法检测结果显示在相同的时间点，随着地西他滨作用浓度增加，各组活细胞数呈下降趋势，在24、48、72 h时间点，各浓度组活细胞计数差异均有统计学意义（F值分别为9.222、17.037、42.935，P值分别为0.006、0.001、<0.001），各浓度组与对照组相比差异均具有统计学意义（P值均<0.05）。在各浓度组中，24 h活细胞计数与对照组相比，差异均无统计学意义（P值分别为0.067、0.211、0.382），而在48 h、72 h活细胞计数与对照组相比，差异均有统计学意义（P值均<0.001）。表明地西他滨对K562细胞的增殖抑制作用在一定范围内呈时间-剂量效应关系。详见图3。

图3

细胞计数法检测地西他滨抑制K562细胞增殖作用

3．地西他滨处理K562细胞后对TFPI-2基因启动子甲基化的影响：MS-PCR检测发现在K562细胞中TFPI-2基因呈不完全甲基化状态，经2、5、10 µmol/L地西他滨处理48 h后，K562细胞中TFPI-2基因启动子甲基化程度逐渐减低，呈浓度依赖性关系，在较高药物浓度（10 µmol/L）时，MS-PCR未能检测出TFPI-2基因甲基化扩增片段（图4）。

图4

甲基化特异性PCR检测不同浓度地西他滨处理K562细胞后TFPI-2基因甲基化状态

m：甲基化扩增产物；u：非甲基化扩增产物；M：Marker；1~4：0、2、5、10 µmol /L地西他滨作用组

4．地西他滨对K562细胞TFPI-2蛋白表达的影响：经过2、5、10 µmol/L地西他滨处理K562细胞后，Western blot法检测其细胞内TFPI-2蛋白表达变化，结果显示在空白对照组TFPI-2蛋白呈低表达，经不同浓度地西他滨处理后，TFPI-2蛋白表达增高，且呈浓度依赖性（图5）。

图5

Western blot法检测不同浓度地西他滨处理48 h后K562细胞TFPI-2蛋白表达水平

1~4分别为0、2、5、10 µmol/L地西他滨作用组

5．地西他滨对K562细胞周期和凋亡的影响：与空白对照组比较，5 µmol/L地西他滨处理K562细胞48 h后，处于G0/G1期细胞由32.51%增至43.30%，G2/M期细胞由14.02%增至28.28%，S期细胞由48.85%减少至32.49%，提示地西他滨使K562细胞周期阻滞于G0/G1和G2/M期，从而抑制细胞的增殖。此外，地西他滨处理48 h后，K562细胞的早期凋亡细胞百分比由空白对照组的1.44%上升至2.78%，提示地西他滨对K562细胞凋亡的诱导作用较弱。

讨论

表观遗传失调是许多肿瘤包括AML的发病机制之一，基因启动子区域CpG岛位点甲基化介导的抑癌基因失活在AML的发生发展中扮演重要角色[6]–[7]。TFPI-2作为一重要的抑癌基因，已经被证实在多种恶性肿瘤细胞中由于启动子区域CpG岛位点甲基化引起TFPI-2蛋白表达显著减低，导致肿瘤细胞的侵袭转移能力显著增强[8]。研究发现TFPI-2不但能调控肿瘤细胞的侵袭转移，而且与肿瘤细胞的增殖也密切相关[9]。本研究结果显示初诊的AML患者TFPI-2基因启动子甲基化的发生率为63.6%，与邵丽丽等[4]报道的AML患者TFPI-2基因甲基化发生率64.63%基本一致。AML患者TFPI-2表达水平明显减低，且患者TFPI-2基因的表达水平与患者临床分期及疾病预后相关，即TFPI-2表达水平越低，化疗效果越差。

地西他滨是一种DNA甲基化转移酶抑制剂，能够通过去除异常的甲基化而恢复抑癌基因的表达，从而实现抗肿瘤的作用，在临床上已经被应用于骨髓增生异常综合征（MDS）的治疗中，同时在AML的前期临床试验研究中，也表现出显著疗效，但其调控靶分子及抗白血病的分子机制仍不完全清楚[10]。本实验结果显示，10 µmol/L地西他滨对K562细胞中TFPI-2基因启动子去甲基化效率最高，与部分文献报道的5 µmol/L浓度有差异，可能与以下因素有关：实验使用的地西他滨是小剂量包装的临床药品，其纯度和药物活性分子可能与专用的科研试剂存在差异；此外，不同细胞株对地西他滨的药物反应也可能存在差异。TFPI-2基因启动子高度甲基化状态被逐渐解除，去甲基作用随地西他滨浓度增高和处理时间延长而增强，细胞内TFPI-2蛋白表达水平呈时间与浓度依赖性升高。Hamamoto等[11]研究发现地西他滨能使非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）内TFPI-2基因启动子去甲基化，使其基因表达水平增高，然后再通过高表达的TFPI-2抑制TMPRSS4基因转录，导致NSCLC细胞增殖显著受抑。地西他滨对K562细胞有显著的增殖抑制作用，且随药物浓度的增加和作用时间的延长，其细胞增殖抑制作用越来越显著，与对照组比较K562细胞分裂周期受阻、凋亡细胞略有增加，结果提示地西他滨抑制K562细胞增殖可能主要通过调控K562细胞周期而实现。Weeks等[12]发现在儿童急性B淋巴细胞白血病中，地西他滨通过使TES基因启动子去甲基化，恢复该基因的表达水平后，白血病细胞通过非TP53活性依赖方式诱导细胞凋亡及细胞周期受阻调控B淋巴细胞白血病细胞的增殖。刘进等[13]发现地西他滨解除急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt4细胞中乳铁蛋白（LTF）基因启动子CpG岛甲基化后，能有效抑制Molt4细胞的增殖，抑制率呈时间和剂量依赖性增加，使细胞周期阻滞于G0/G1期，并能诱导细胞凋亡。

总之，TFPI-2基因在AML疾病发生发展过程中可能发挥重要的负调节作用。地西他滨能有效抑制K562细胞增殖，部分原因可能与其解除TFPI-2基因启动子甲基化效应，恢复TFPI-2基因表达相关，因而，本研究结果可为深入阐明地西他滨治疗AML的分子机制提供新的实验数据。