[The mechanism of bone marrow-derived mesenchymal stem cells excessive senescence in severe aplastic anemia mouse model].

Objective: To explore the mechanism of excessive senescence in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSC) of mouse model with severe aplastic anemia (SAA) .
Methods: 40 BALB/c mice were randomly assigned to two groups of control (n=20) and AA (n=20) . SAA mouse model was induced by intraperitoneal injection with IFN-γ and intragastric infusion with busulfan. BM-MSC were isolated and cultured from bone marrow of SAA and healthy mice. The cell morphology was observed by inverted microscope and cell cytoskeleton was stained by Rhodamine-Phalloidin; The level of proliferation was analyzed by CCK-8 method, and cell cycle was tested by flow cytometry. Senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) assay was used to detect senescent BM-MSC; The expression of mTOR protein was detected by Western blot method.
Results: BM-MSC from normal mice presented spindle-shaped, clear boundaries and stress fibers were arranged in parallel, neat. while BM-MSCs from SAA mice presented cell volume increases, tiled, ill-shaped and the stress fiber appeared to be disordered. The decreased activity of proliferation [more cells restricted in G(0)/G(1) phase [ (77.461±1.567) % vs (46.045±2.055) %, t=-34.384, P<0.001], increased percentage of SA-β-gal positive cells [ (75±11) % vs (28±8) %, t=15.454, P<0.001] and notably enhanced expression of mTOR of BM-MSC from SAA mice were observed when compared with those from normal mice.
Conclusion: This study clarified senescent BM-MSCs from SAA model mice, which could be caused by the excessive activation of mTOR pathway.

再生障碍性贫血（AA）是一种骨髓造血衰竭综合征，其发病机制尚未完全明确，尽管近十年的研究更强调免疫异常的主导作用，普遍认为AA是一种由活化的T淋巴细胞及其分泌的淋巴因子导致的造血干细胞过度凋亡[1]。但造血微环境，尤其骨髓间充质干细胞（BM-MSC）的异常仍应引起重视。BM-MSC是骨髓造血微环境的重要组分，其分化产生的成骨细胞、成软骨细胞等基质细胞也是构成骨髓微环境的组分，并且能分泌IL-6、IL-11、IL-12等多种细胞因子共同维持造血微环境的稳定[2]–[3]。既往研究证实AA患者BM-MSC体外培养的增殖能力以及支持造血的能力显著低于健康对照者[4]。细胞增殖能力的下降以及生理功能的减退是细胞衰老的特征之一，BM-MSC是否由于衰老而影响了骨髓微环境正常的支持造血的功能？已知细胞衰老后通常表现出衰老相关β-半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）活性的增加[5]。而mTOR信号通路通过降低多潜能基因Nang和Oct-4的表达等方式参与了多种细胞的衰老过程[6]。为此，我们比较了正常小鼠与重型AA（SAA）模型小鼠BM-MSC细胞的形态、骨架、增殖、SA-β-gal活性及mTOR蛋白表达等情况，验证SAA小鼠BM-MSC是否衰老，并探寻AA发病中骨髓造血微环境缺陷的可能机制。

对象与方法

1．研究对象及分组：近交系雌性BALB/c小鼠40只，SFP级，8~9周龄，体重18~22 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（合格证号：2015000511717），均饲养于南通大学医学院实验动物中心。取40只小鼠随机分为2组，设为SAA组与正常组，每组20只。SAA组参照文献[7]方法，通过白消安灌胃及腹腔注射IFN-γ 10 d诱导建立BALB/c SAA模型小鼠。同时给予正常组小鼠等量等浓度生理盐水灌胃及腹腔注射。

2．主要试剂和仪器：BALB/c小鼠BM-MSC完全培养基购自赛业（广州）生物科技有限公司；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、罗丹明-鬼笔环肽购自美国Invitrogen公司；CCK-8试剂购自日本Dojindo公司；细胞周期与凋亡检测试剂盒、SA-β-gal染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗鼠mTOR单克隆抗体购自英国Abcam公司；GADPH购于美国Bioworld公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD公司；Western blot全套仪器购自美国Bio-Rad公司。

3．分离培养BM-MSC：采用颈椎脱臼法处死小鼠，于75%乙醇中浸泡3 min，无菌条件下分离双侧股骨和胫骨，修剪干骺端后用完全培养基冲洗骨髓，制成细胞悬液并用70 mm滤网过滤。离心收集细胞后用完全培养基重悬调整细胞密度为25×106个/ml接种于25 cm2培养瓶（5 ml），置于37 °C、5%CO2培养箱培养。48 h后首次换液，去除非贴壁细胞，以后每3~4 d换液1次。倒置显微镜下观察贴壁细胞培养至90%融合时，消化细胞并按1∶2比例传代培养，并记为第一代（P1代）细胞。

4．细胞形态观察和骨架荧光染色：倒置显微镜下观察P4代BM-MSC的细胞形态并拍照记录。将接种培养于盖玻片的P3代BM-MSC细胞用4%多聚甲醛固定15 min后用PBS洗涤3次，每次5 min；正常驴血清（1∶50）和羊血清（1∶50）混匀后滴于盖玻片上，室温放置30 min。将罗丹明-鬼笔环肽（红）（1∶50）滴于盖玻片上孵育1 h后PBS洗涤，后用DAPI染核20 min。甘油封固后用荧光显微镜观察细胞骨架。

5．细胞增殖和细胞周期检测：收集P3代细胞，按细胞密度为5 000/100 µl接种于96孔板中，分别培养1、2、3、4、5 d后加入CCK-8溶液继续培养2 h，用酶联免疫检测仪测定450 nm处吸光度（A）值，实验设3个复孔，重复3次。收集P3代细胞，预冷PBS洗涤后用70%乙醇固定12 h，用PBS洗涤后加入碘化丙锭（PI）300 µl，37 °C避光温育30 min后用流式细胞仪检测，实验设2个复孔，重复4次。

6．SA-β-gal检测细胞衰老：收集P3代细胞接种培养于12孔板中，PBS洗涤后每孔加入500 µl SA-β-gal染色固定液，室温反应15 min，PBS洗涤后加入染色液工作液500 µl，保鲜膜封住孔板防止蒸发，37 °C孵育6 h。显微镜下观察、拍照并计算每100个BM-MSC中SA-β-gal阳性比例，实验设3个复孔，重复3次。

7．Western blot检测mTOR蛋白的表达：收集P3代BM-MSC，RIPA+PMSF裂解液冰浴裂解，提取总蛋白。BCA法测蛋白浓度。加入适量SDS上样缓冲液后沸水煮15 min，−80 °C保存备用。用SDS-PAGE凝胶电泳、转膜，脱脂奶粉封闭2 h后加一抗稀释液（1∶1 000）4 °C孵育过夜。洗膜后加HRP标记的二抗（1∶4 000）室温孵育2 h。洗膜后ECL显色，以GADPH为内参。

8．统计学处理：采用SPSS 16.0软件进行数据处理。CCK-8、细胞周期各期比率、SA-β-gal阳性比例的数据用均数±标准差（数据符合正态分布）表示，细胞增殖率采用重复测量方差分析进行比较，两组的细胞周期各期比率及SA-β-gal阳性比例采用t检验进行比较。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．细胞形态和骨架的改变：在倒置显微镜下观察两组小鼠BM-MSC的P4代细胞形态，正常组小鼠的BM-MSC细胞仍保持纺锤状形态，边界清晰。而SAA小鼠的BM-MSC细胞体积增大，呈平铺、边界不清的状态（图1）。在荧光显微镜下观察，正常小鼠的BM-MSC中可清晰观察到贯穿细胞全长的应力纤维，且平行排列整齐。而SAA小鼠的BM-MSC的细胞应力纤维紊乱模糊（图2），提示SAA小鼠BM-MSC存在形态异常及衰老。

图1

BALB/c小鼠第4代骨髓间充质干细胞（BM-MSC）形态（中倍）

A：正常小鼠；B：重型再生障碍性贫血模型小鼠

图2

BALB/c小鼠第4代骨髓间充质干细胞（BM-MSC）骨架

A：正常小鼠；B：重型再生障碍性贫血模型小鼠

2．增殖能力的改变：正常组和SAA组BM-MSC培养1~5 d CCK-8结果比较显示，不同时间点的数据差异有统计学意义（P<0.05），两组之间的差异有统计学意义（P<0.05），且两组的增殖趋势大致相同，均随时间的增加呈升高趋势，但SAA组小鼠的BM-MSC的增殖速率较正常组的缓慢，差异有统计学意义（P<0.05）（图3）。进一步检测细胞周期显示，SAA组小鼠BM-MSC G0/G1期细胞的比例明显高于正常组，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

图3

CCK-8检测正常和重型再生障碍性贫血（SAA）模型小鼠骨髓间充质干细胞增殖情况（实验设3个复孔，重复3次）

表1

两组小鼠骨髓间充质干细胞的细胞周期比率的比较（%）

组别	鼠数（只）	G0/G1期	S期	G2/M期
正常组	8	46.045±2.055	30.739±3.468	23.216±5.407
SAA组	8	77.461±1.567	9.420±2.057	13.122±2.749
t值		−34.384	14.955	4.707
P值		<0.001	<0.001	<0.001

注：SAA：重型再生障碍性贫血。实验设2个复孔，重复4次

3．SA-β-gal阳性细胞比例和mTOR表达的改变：本实验分别检测正常小鼠和SAA小鼠BM-MSC的SA-β-gal阳性细胞的比例，结果显示，SAA组的SA-β-gal阳性细胞比例为（75±11）%，高于正常组的（28±8）%，差异有统计学意义（t=15.454, P<0.001）。进一步通过Western blot检测正常和SAA小鼠BM-MSC的mTOR表达水平，SAA小鼠1和SAA小鼠2 mTOR相对表达水平分别为1.51、1.37，显著高于正常小鼠1和正常小鼠2的0.65、0.60（图4）。

图4

Western blot法检测正常和重型再生障碍性贫血模型小鼠骨髓间充质干细胞mTOR蛋白表达水平

1：正常小鼠1；2：SAA小鼠1；3：正常小鼠2；4：SAA小鼠2

讨论

BM-MSC是骨髓造血微环境的重要组分，与造血干细胞（Hematopoietic stem cells, HSC）均是维持骨髓正常造血的重要细胞。HSC通过自我更新和分化维持造血功能，BM-MSC则提供HSC所需细胞因子，并通过细胞接触与HSC相互作用，维持正常造血[8]。临床已证实MSC和HSC的联合输注可提高AA患者的造血重建率[9]–[10]。既往的研究表明AA患者中BM-MSC存在增殖异常且更易分化成抑制造血的脂肪细胞，难以分化成促进造血的成骨细胞[11]–[13]，但其机制尚不清楚。作为骨髓微环境的重要组分，BM-MSC的质和量的变化都对于骨髓造血情况有着重要的调节作用。

我们应用白消安联合IFN-γ构建的SAA小鼠模型有显著的外周血三系减少、骨髓脂肪化明显、骨髓有核细胞计数和脾脏指数显著减低等表现，且外周血及脾脏存在调节性T细胞数量减少和Th17细胞数量增加，脾脏调节性T细胞凋亡率升高，Akt、TGF-β表达水平的下降[5],[7],[14]。本研究中我们观察到，与正常小鼠相比较，SAA小鼠的BM-MSC的细胞体积增大，呈平铺、边界不清的状态，明显异于正常小鼠BM-MSC的纺锤状。为进一步了解细胞的骨架变化，我们使用罗丹明-鬼笔环肽对细胞的肌动蛋白进行染色，观察到SAA小鼠BM-MSC的细胞应力纤维紊乱模糊，而正常组清晰且排列整齐，提示SAA小鼠BM-MSC存在形态异常。衰老的MSC典型特征除去有细胞体积增大、呈扁平形态、肌动蛋白应力纤维发生改变外，当细胞衰老时，细胞虽然维持着代谢活性，但因周期阻滞在G1期而失去了进行有丝分裂的能力[15]–[17]。本研究中，我们观察比较了SAA小鼠和正常小鼠的BM-MSC的细胞增殖情况和细胞周期改变，SAA小鼠的BM-MSC增殖活性显著降低，G1期的比例则明显增高。提示SAA小鼠的BM-MSC呈衰老状态。Dimri等[18]在1995年即首次报道SA-β-gal可以作为细胞衰老检测的良好指标，今已普遍作为衰老细胞的标志物[19]–[21]。因此，我们还进行了SA-β-gal检测，发现SAA小鼠BM-MSC的SA-β-gal阳性细胞比例明显高于正常小鼠的BM-MSC，进一步证实了SAA小鼠BM-MSC过度衰老这一结论。相关研究表明，mTOR信号通路的激活与包括MSC在内的多种细胞衰老过程的发生发展密切相关[22]–[24]。为进一步证明SAA小鼠BM-MSC衰老的机制，我们检测了小鼠BM-MSC mTOR的表达水平，结果显示SAA小鼠BM-MSC mTOR的表达水平显著高于正常组，提示mTOR信号通路可能参与了BM-MSC的衰老机制。有关mTOR信号通路如何介导BM-MSC的衰老尚有待进一步研究。

综上所述，SAA小鼠模型中BM-MSC是衰老的MSC，mTOR通路的过度激活可能是导致其衰老发生的机制。进一步探寻MSC衰老的分子机制有助于探索骨髓微环境障碍介导的AA发病机制，并为新的治疗提供理论依据。