[Significance of BCR-ABL fusion gene detection in CD34 (+) cells of chronic myelogenous leukemia patients].

慢性髓性白血病（CML）是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病[1]。其特征性标志是Ph染色体及BCR-ABL融合基因。酪氨酸激酶抑制剂（TKI）作为CML患者靶向治疗药物，极大程度提高了CML患者的临床疗效，现已成为CML临床一线治疗药物[2]。但是，长期服用TKI仍存在血液学和非血液学不良反应、TKI耐药以及经济负担重等问题。因此，如何安全停药以及安全停药的标准成为目前研究的热点。我们检测32例CML患者CD34+细胞内BCR-ABL融合基因转录水平，初步探讨其与CML疾病状态的关系。

病例与方法

1．病例来源：我院2014年9月至2016年10月收治的32例CML患者，诊断标准均符合文献[2]。中位TKI治疗时间38（24~68）个月，疗效评价达完全分子学反应（CMR），获得CMR中位时间为12（9~15）个月，疗效评价参照文献[2]标准。其中男21例，女11例，中位年龄45（20~60）岁。本试验经我院伦理委员会批准，所有患者均知情并签署知情同意书。

2．主要试剂及仪器：人CD34+细胞分选磁珠、autoMACS Running Buffer、QuadroMACS分选器、MACS LS细胞分选柱均为德国美天旎生物技术有限公司产品；OMEGA Micro Elute总RNA提取试剂盒为美国Omega Bio-Tek公司产品；ABI 7500实时荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品；BD FACSCalibur全自动多色分析流式细胞仪系统为美国BD公司产品；紫外分光光度计购自GE医疗集团。

3．免疫磁珠法提纯CD34+细胞：取已达CMR的CML患者新鲜骨髓8 ml，加入肝素液2 ml抗凝，应用红细胞裂解液分离单个核细胞。计数单个核细胞，加入相应剂量的FcR Blocking Reaqent以及CD34+细胞分选磁珠，孵育30 min后，洗脱未结合的磁珠抗体。加入3 ml缓冲液吹打混匀后过分离柱。细胞悬液全部通过分离柱后，将分离柱移出磁场，加入3 ml缓冲液，迅速加入新的15 ml离心管。离心后弃上清液得到CD34+细胞，分离少量细胞，采用流式细胞术测定CD34+细胞纯度。

4．RT-PCR技术检测BCR-ABL融合基因：应用OMEGA Micro Elute总RNA提取试剂提取CD34+细胞内的RNA，严格按照说明书操作，并采用分光光度法测定RNA纯度及浓度，取吸光度（A）260/A280≥1.80为合格样品。将提取的RNA置于−80 °C冰箱保存。

利用反转录试剂盒将获得的RNA进行反转录获得模板链cDNA，以cDNA为模板，利用PCR试剂盒完成PCR。相关引物序列及探针选择按照Beillard等[3]报道的方法设计并合成。按照秦亚溱等[4]报道的方案在ABI prism 7500 PCR系统中进行BCR-ABL转录本水平检测。根据标准曲线分别计算标本中ABL及BCR-ABL的拷贝数，如果ABL拷贝数≥3×104，即认为该标本合格。按照以下公式计算BCR-ABL水平：BCR-ABL水平（%）=（BCR-ABL拷贝数/ABL拷贝数）×100%。

5．观察指标：观察患者CD34+细胞内BCR-ABL转录本的水平、TKI治疗时间、获得CMR时间、检测时间、附加染色体异常、疾病状态及治疗情况等。

结果

32例患者均未发现附加染色体异常。口服伊马替尼27例，伊马替尼转达沙替尼3例，伊马替尼转尼洛替尼2例，转换时间及转换原因见表1。32例患者中CD34+细胞BCR-ABL阳性12例（37.5%），阴性20例（62.5%）。阳性患者中，男7例，女5例，中位年龄42（20~60）岁，中位TKI治疗时间31（26~40）个月，阳性患者CD34+细胞内BCR-ABL转录本水平在0.002%~0.510%，口服TKI获得CMR中位时间为9（9~15）个月，检测CD34+细胞内BCR-ABL转录本中位时间为获得CMR后的19（5~30）个月，其中口服伊马替尼11例，伊马替尼转尼洛替尼1例。阴性患者中，男14例，女6例，中位年龄45（23~64）岁，中位TKI治疗时间44（24~68）个月，口服TKI获得CMR的中位时间为12（9~15）个月，检测CD34+细胞内BCR-ABL转录本中位时间为获得CMR后的26（3~47）个月，其中口服伊马替尼16例，伊马替尼转达沙替尼3例，伊马替尼转尼洛替尼1例。截止到随访结束，所有患者均继续口服TKI治疗，且均维持CMR状态。所有患者基本情况见表1。

表1

32例慢性髓性白血病患者的基本情况

例号	性别	年龄（岁）	骨髓或外周血BCR-ABL水平	CD34+细胞BCR-ABL水平（%）	TKI类别	应用TKI时间（月）	获得CMR时间	CD34+细胞BCR-ABL融合基因检测时间（月）a	更换TKI原因及时间
1	男	42	-	0.070	尼洛替尼	26	更换尼洛替尼后9个月	5	伊马替尼及达沙替尼不耐受，12个月
2	男	44	-	0.070	伊马替尼	28	9个月	17
3	男	57	-	-	伊马替尼	30	12个月	18
4	男	59	-	-	伊马替尼	38	12个月	26
5	男	37	-	-	伊马替尼	38	12个月	26
6	男	45	-	-	尼洛替尼	27	更换尼洛替尼后12个月	3	伊马替尼疗效差，12个月
7	女	23	-	-	伊马替尼	31	12个月	19
8	女	24	-	-	伊马替尼	24	12个月	12
9	女	20	-	0.040	伊马替尼	31	9个月	22
10	女	28	-	0.510	伊马替尼	39	9个月	30
11	男	41	-	-	伊马替尼	45	15个月	30
12	男	55	-	-	伊马替尼	45	12个月	37
13	男	30	-	-	伊马替尼	40	12个月	28
14	男	35	-	-	达沙替尼	40	更换达沙替尼后12个月	10	出现E225K突变，18个月
15	女	60	-	0.022	伊马替尼	28	9个月	19
16	女	58	-	0.016	伊马替尼	40	12个月	28
17	男	27	-	-	伊马替尼	49	12个月	37
18	男	29	-	-	伊马替尼	56	9个月	47
19	男	37	-	0.036	伊马替尼	27	9个月	18
20	男	46	-	0. 210	伊马替尼	26	15个月	11
21	男	43	-	0.002	伊马替尼	36	9个月	27
22	男	49	-	0.003	伊马替尼	33	12个月	21
23	女	45	-	-	达沙替尼	64	更换达沙替尼后12个月	14	伊马替尼治疗后失去CMR，30个月
24	女	27	-	-	达沙替尼	68	更换达沙替尼后12个月	3	伊马替尼治疗后失去CMR，43个月
25	女	39	-	-	伊马替尼	50	9个月	41
26	女	45	-	-	伊马替尼	48	12个月	36
27	男	60	-	-	伊马替尼	32	9个月	23
28	男	57	-	-	伊马替尼	36	12个月	24
29	男	54	-	-	伊马替尼	44	12个月	32
30	女	45	-	0.030	伊马替尼	35	9个月	26
31	男	64	-	-	伊马替尼	45	12个月	33
32	男	46	-	0.007	伊马替尼	31	12个月	19

注：TKI：酪氨酸激酶抑制剂；CMR：完全分子学反应；a指CMR后的时间；-：低于最低检测极限；我中心BCR-ABL转换系数为0.81

讨论

CML是骨髓造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，占成人白血病的15%[1]。以伊马替尼为代表的多种TKI作为一线治疗药物使CML患者的10年生存率达85%~90%[2]。然而，长期应用TKI仍存在血液学及非血液学不良反应、耐药、经济负担重及对妊娠的影响等相关问题。因此，如何安全停药以及安全停药的标准成为目前研究的热点。

2010年Mahon等[5]进行了一项旨在探索安全地停止应用伊马替尼的临床试验。他们选取了应用伊马替尼治疗2年以上并达CMR的患者，停止应用伊马替尼后，定期监测这些患者BCR-ABL转录本水平，评估疾病状态。随访1年后发现复发率高达61%。并且在复发的患者中，有95%的患者在停药的前6个月内出现复发。同时后续进行的一系列相关的TKI停药试验所报道的分子学复发率为44%~71%，并且有少量患者甚至进入加速或急变期[6]–[11]。这些研究表明，即使获得CMR的CML患者，停止应用TKI的风险也是很高的。

那么，在已经获得CMR的患者中，导致疾病复发的根源究竟在哪里？2011年，Chomel等[12]提纯CML患者骨髓液中CD34+细胞，并进行体外培养，随后在这些细胞中检测出了BCR-ABL融合基因的表达。这项试验提示在CML患者的干细胞中也存在BCR-ABL的复制和表达，而导致疾病复发的原因可能就在于这些干细胞，因此监测干细胞的BCR-ABL表达水平可以更准确地了解疾病的真实状态。随后van Kooten Niekerk等[13]收集了17例应用TKI治疗后达CMR的CML患者的新鲜骨髓液，经流式细胞术分选出CD34+细胞，通过iFISH及RT-PCR方法分别检测干细胞BCR-ABL融合基因的表达水平，其阳性率分别为41%和21%。

我们采用免疫磁珠法提纯CD34+细胞，提取RNA后应用RT-PCR技术检测BCR-ABL转录本水平，此方法提纯CD34+细胞简便快捷，且获得的干细胞纯度高，无杂质细胞干扰。32例患者中，BCR-ABL转录本阳性占37.5%，高于van Kooten Niekerk等报道的21%阳性率。从实验结果可以看出，即使获得CMR的患者，部分患者的CD34+细胞中仍可检测出BCR-ABL融合基因的转录，需要口服TKI治疗。同时部分因初始伊马替尼疗效差或出现基因突变而更换药物的患者，仍可获得CD34+细胞内BCR-ABL融合基因转录阴性，提示这些患者有机会安全停药。但是目前检测病例数较少，且尚未对阳性患者进行动态监测，无法明确患者CD34+细胞内融合基因水平与疾病状态及停药的关系。因此，仍需扩大病例、增加检测次数、延长随访时间，以明确CD34+细胞内BCR-ABL融合基因与CML疾病状态的真正关系。