[Identification of miR-639 expression in myelodysplastic syndrome and its target gene prediction].

miRNA是一类长为20~28个核苷酸的非编码小RNA，在细胞增殖、凋亡、分化等过程中起重要作用[1]。本课题组前期研究显示miR-639在骨髓增生异常综合征（MDS）患者骨髓中呈特异性低表达。为了进一步验证该结论，本研究中我们扩大临床样本，利用RT-PCR检测MDS患者骨髓单个核细胞miR-639的表达情况，分析其与MDS临床特征的相关性，并利用生物信息学预测miR-639在MDS中的潜在靶基因。

病例与方法

1．临床资料：病例选自2011年至2014年在广西医科大学第一附属医院血液内科诊治的70例MDS患者（男44例，女26例，中位年龄55.0岁），其中18例MDS患者转化为急性髓系白血病（AML）。MDS的诊断参照“骨髓增生异常综合征诊断与治疗中国专家共识（2014版）”，患者均为初诊或者入选前未进行放、化疗，未合并其他血液肿瘤及严重的消耗性疾病，同时我们收集患者的临床资料（包括血常规、骨髓原始细胞比例、染色体核型）。染色体重复、易位、缺失、复杂核型定义为异常核型，70例患者中正常核型42例，异常核型28例。正常对照组选取同期性别、年龄相匹配的19名健康志愿者及异基因造血干细胞供者（男11名，女8名，中位年龄43.0岁）。对照组均符合正常献血员的标准。本研究经我院伦理委员会批准，标本的获得均经研究对象知情同意并签署知情同意书。

2．RT-PCR检测miR-639表达：取MDS患者和正常对照组骨髓后分离单个核细胞，用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司产品）提取总RNA并验证RNA浓度和纯度。取检测合格的700 ng RNA样本，按照使用说明书分别加入dNTP 2 µl、10×Buffer 2 µl、PCR特异性引物（上海百力格生物技术有限公司产品）0.3 µl、M-MLV逆转录酶0.2 µl、RNA酶抑制剂0.3 µl，加入无RNA酶水至20 µl配制成PCR混合反应液，然后在Gene Amp 9700 PCR仪（美国Applied Biosystems公司产品）进行反应。将逆转录成的cDNA在ViiA 7 RT-PCR仪（美国Applied Biosystems公司产品）上完成PCR反应。反应体系如下：2×Master Mix 5 µl，上下游引物（10 µmol/L）各0.5 µl，加双蒸水至总体积为8 µl。其中PCR特异引物（GSP）由Primer 5.0设计完成（U6：上游引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-639：GSP：5′-CGCTGCGGTTGCGAG-3′，下游引物：5′-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3′）。反应条件：95 °C 10 min；95 °C 10 s，60 °C 60 s，40个循环；95 °C 10 s，60 °C 60 s，95 °C 15 s，并从60 °C缓慢加热至99 °C。每组样本设3个复孔，取平均Ct值，采用2−ΔΔCt法计算miR-639的相对表达量。

3．miR-639靶基因的预测：运用Microcosm（http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/）、Miranda（http://www.microrna.org/microrna/）和Targetscan（http://www.targetscan.org/）三种在线软件预测miR-639的靶基因，取三者交集作为潜在的靶基因。

4．靶基因的功能分析：Gene Ontology分析（GO）采用Cytoscape（http://www.cytoscape.org）及其插件BiNGO对miR-639潜在靶基因进行功能分析。根据GO注释中分子功能、生物学过程、细胞组分进行GO注释层次分类和富集分析，并用BiNGO对相应的GO注释进行显著性分析。采用KEGG公共数据库（http://www.genome.jp/）对潜在的靶基因进行信号转导通路分析。

5．统计学处理：采用SPSS 17.0对数据进行统计分析。均数间的比较用t检验（符合正态分布），分类资料间的比较用χ2检验。miR-639的表达量与临床特征的相关性采用Spearman秩相关及列联表相关性分析。GO分析和KEGG信号转导通路分析中用Fisher确切概率计算。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．miR-639在MDS中的相对表达量：相对于对照组，miR-639在MDS组骨髓中表达水平均降低（0.61±0.31对0.95±0.30，t=−4.125，P<0.001）。

2．miR-639相对表达量与MDS患者临床特征的相关性分析：MDS患者染色体情况与miR-639的相对表达量有相关性（C=0.378，P=0.010），并且染色体异常组miR-639的相对表达量低于正常组（0.54±0.29对0.79±0.31，t=−2.500，P=0.015）。MDS患者外周血血常规与miR-639表达量之间均无明显相关性（ANC：r=0.033 P=0.829；HGB：r=−0.036，P=0.809；PLT：r=−0.148，P=0.326），骨髓原始细胞比例与miR-639的相对表达量呈负相关（r=−0.527，P<0.001）。

3．miR-639靶基因的预测：Microcosm、Miranda和Targetscan三种在线软件进行miR-639靶基因预测分别有847、868、15个候选靶基因，取三者的交集得到共同的4个潜在靶基因，分别为IRX1（ID：79192）、KIAA1267（ID：284058）、POU2F2（ID：5452）、TBR1（ID：10716）。

4．潜在靶基因的功能分析：针对以上预测的miR-639的4个潜在靶基因进行GO分析以探究其生物学功能，并投射到分子功能、生物学过程和细胞组分三大功能上，结果显示潜在靶基因在分子功能上主要富集于有机环化合物、DNA、核酸等的结合和特定序列DNA、核酸结合转录因子的活性（表1），在生物学过程上主要富集于RNA生物合成过程、转录过程等的调控（表2），在细胞组分上主要富集于细胞核、胞内膜结合细胞器等（表3）。利用KEGG公共数据库对潜在靶基因进行信号转导通路富集分析，尚未得到相关信号转导通路。

表1

miR-639潜在靶基因GO分析分子功能分类结果（部分）

GO编号	分子功能	基因
0043565	结合特定序列DNA	IRX1 POU2F2 TBR1
1901363	结合杂环化合物	IRX1 POU2F2 TBR1
0097159	结合有机环化合物	IRX1 POU2F2 TBR1
0003677	结合DNA	IRX1 POU2F2 TBR1
0003676	结合核苷酸	IRX1 POU2F2 TBR1
0003700	特定序列DNA结合转录因子活性	POU2F2 TBR1
0001071	核酸结合转录因子活性	POU2F2 TBR1

表2

miR-639潜在靶基因GO分析生物学过程分类结果（部分）

GO编号	生物学过程	基因
0051252	RNA代谢过程的调控	IRX1 POU2F2 TBR1
2001141	RNA生物合成过程的调控	IRX1 POU2F2 TBR1
0006355	DNA模板转录的调控	IRX1 POU2F2 TBR1
0006351	DNA模板转录	IRX1 POU2F2 TBR1
0060255	大分子代谢过程的调控	IRX1 POU2F2 TBR1
0032774	RNA生物合成	IRX1 POU2F2 TBR1
0016070	RNA代谢	IRX1 POU2F2 TBR1

表3

miR-639潜在靶基因GO分析细胞组分分类结果（部分）

GO编号	细胞组分	基因
0005634	细胞核	IRX1 POU2F2 TBR1
0043231	胞内膜结合细胞器	IRX1 POU2F2 TBR1
0043227	膜结合细胞器	IRX1 POU2F2 TBR1
0043226	细胞器	IRX1 POU2F2 TBR1
0043229	胞内细胞器	IRX1 POU2F2 TBR1
0044424	胞内成分	IRX1 POU2F2 TBR1
0044464	细胞成分	IRX1 POU2F2 TBR1

讨论

研究表明miR-639在多种肿瘤中表达异常，参与了肿瘤的发生、发展。其中，在舌鳞状细胞癌系中显著低表达，并与肿瘤的转移及患者的低生存率有关[2]，在膀胱癌组织中出现表达上调并后续验证在患者血清中同样出现表达升高[3]，在转移型乳腺癌组织和细胞系中呈现高表达且促进肿瘤的转移及侵袭[4]。但miR-639在白血病、淋巴瘤等血液系统恶性肿瘤中的研究尚未见文献报道。本研究我们发现miR-639在MDS患者中表达明显下调。目前，MDS的危险度评分主要依赖于外周血血常规、骨髓原始细胞比例及染色体情况。因此我们将miR-639的表达量与这些临床资料做相关性分析，结果发现MDS患者染色体异常与否与miR-639的相对表达量有相关性，并且染色体异常组相比于正常组miR-639的相对表达量低，MDS患者外周血血常规与其表达量之间无明显相关性，但骨髓原始细胞比例与miR-639的相对表达量呈负相关。由此可见，miR-639的表达水平可能与MDS骨髓病态造血有关。临床上我们常根据这些临床病理特征评估MDS患者疾病的状态，但仅通过以上指标有一定的局限性。由于miR-639的表达量与骨髓原始细胞比例呈负相关及与染色体核型异常有关，提示miR-639可以协助外周血、骨髓原始细胞比例等运用于临床，指导MDS早期诊断及治疗。

另外，我们对miR-639的靶基因进行预测，为了减少假阳性率，取预测靶基因的交集，得到4个潜在靶基因。对miR-639潜在靶基因相关文献进行分析，IRX1作为抑癌基因在胃癌和头颈部鳞状细胞癌中低表达，其抑癌作用主要表现在抑制肿瘤侵袭及增殖[5]–[6]。TBR1主要参与神经干细胞的发生过程，其编码的转录因子主要表达于大脑皮层、海马及嗅球[7]–[8]。POU2F2在转移型胃癌细胞系、胃癌、胰腺癌[9]和培养的霍奇金/R-S细胞中表达上调。由POU2F2编码的OCT2在弥漫性大B细胞淋巴瘤中起到致癌因子的作用[10]。KIAA1267（KANSL1）主要与17q21.31缺失综合征有关，同时存在KIAA1267表达水平的降低[11]。KIAA1267参与抑癌基因TP53的乙酰化[12]，KIAA1267突变破坏TP53的功能而导致白血病。根据miRNA对靶基因的负调控，在MDS患者中表达下调的miR-639，其靶基因表达上调及致癌作用。通过靶基因功能分析及相关文献分析总结，最终得出POU2F2可能为miR-639在参与MDS病理过程中的直接靶基因。

POU2F2是一种B细胞特异性转录因子，其正常表达于B细胞中，参与免疫球蛋白、B细胞增殖及分化基因的调节[13]。在转移型胃癌细胞系及胃癌患者中POU2F2表达上调，并促进癌细胞的转移；在胰腺癌[9]和培养的霍奇金/R-S细胞中POU2F2表达上调；由POU2F2编码的OCT2在弥漫性大B细胞淋巴瘤中起到致癌因子作用[10]。POU2F2可以直接引起ROBO1的转录，ROBO1作为一种单通道膜受体与SLIT家族配体相互作用致肿瘤细胞的转移。在发现的三种SLIT蛋白（SLIT1-3）中，SLIT1特异表达于脑组织中[14]，SLIT3在胃癌组织中表达下调，因此我们推测POU2F2可能通过SLIT2/ROBO1信号通路参与肿瘤的病理过程。研究表明在MDS发病中存在ROBO1突变及SLIT2/ROBO1信号通路在MDS疾病进展中起到重要的作用[15]。上调表达的POU2F2使膜受体ROBO1表达升高，从而增加了ROBO1突变的概率。ROBO1纤连蛋白和细胞内区域的突变不再起到促进凋亡、抑制增殖的作用，破坏SLIT2/ROBO1信号通路致使细胞增殖与凋亡失衡，从而加速MDS的进展。同时，在胃癌患者细胞中POU2F2的高表达与NF-κB的过度激活有关，在培养的霍奇金/R-S细胞中POU2F2和NF-κB高表达。因此我们推测POU2F2在肿瘤中高表达与NF-κB的激活有关。NF-κB是一种调控凋亡的重要因子，活化的NF-κB诱导抗凋亡蛋白的表达，从而抑制细胞凋亡导致细胞无限增殖。通过对NF-κB的活化，IFN-γ和TNF-α会诱导MDS原始细胞表达B7-H1并与PD-1结合导致MDS原始细胞增殖[16]。因此，我们推测低表达的miR-639通过负调控使POU2F2表达升高，可能通过破坏SLIT2/ROBO1信号通路和激活NF-κB参与MDS的病理过程。

本研究我们通过检测MDS患者骨髓中miR-639的表达情况，并通过对miR-639靶基因进行预测并结合文献报道，推测POU2F2可能作为miR-639的直接靶基因参与MDS病理过程。但目前关于预测miRNA靶基因的数据库仍不够完善，预测结果可能存在假阳性。因此，后续仍需对miR-639靶基因进行验证。