Beta Emitter Radionuclides (90Sr) Contamination in Animal Feed: Validation and Application of a Radiochemical Method by Ultra Low Level Liquid Scintillation Counting.

90Sr is considered as a dangerous contaminant of agri-food supply chains due to its chemical affinity with Calcium, which makes its absorption in bones easy. 90Sr accumulation in raw materials and then in final products is particularly significant in relationship to its ability to transfer into animal source products. The radionuclides transfer (137Cs and 90Sr) from environment to forages and then to products of animal origin (milk, cow and pork meats) was studied and evaluated in different studies, which were carried out in contaminated areas, from Chernobyl disaster until today. In the present work, the development and validation of a radiochemical method for the detection of 90Sr in different types of animal feed, and the application of this technique for routinely control activities, are presented. Liquid scintillation counting was the employed analytical technique, since it is able to determine very low activity concentrations of 90Sr (<0.01 Bq Kg-1). All samples analysed showed a 90Sr contamination much higher than method detection limit (0.008 Bq kg-1). In particular, the highest mean activity concentration was registered in hay samples (2.93 Bq kg-1), followed by silage samples (2.07 Bq kg-1) and animal feeds (0.77 Bq kg-1). In fact, all samples were characterized by 90Sr activity concentrations much lower than reference limits. This notwithstanding, the necessity to monitor these levels was confirmed, especially considering that 90Sr is a possible carcinogen for human.

Introduzione

Lo 90Sr è un radionuclide artificiale, prodotto per fissione dell’235U. Lo 90Sr decade in 90Y emettendo particelle beta, con un tempo di dimezzamento pari a 28.5 anni ed una energia massima di emissione pari a 546 keV. L’90Y prodotto decade a sua volta, emettendo particelle beta, in 90Zr stabile. Tale decadimento è caratterizzato da un tempo di dimezzamento pari a 64.1 ore e da una energia massima di emissione pari a 2284 keV (Stamoulis et al., 2007).

Caratteristica molto importante dal punto di vista analitico è la capacità di 90Sr e 90Y di raggiungere il cosiddetto equilibrio secolare ovvero lo stato in cui le concentrazioni di attività dei due isotopi sono equivalenti. Essendo l’energia massima di emissione dell’90Y circa 5 volte maggiore rispetto a quella dello 90Sr, risulta favorevole la sua determinazione, in luogo di quella del radioisotopo progenitore, con evidente guadagno in sensibilità analitica (dell’Oro et al., 2013).

Lo90Sr è considerato un pericoloso contaminante delle filiere agroalimentari in quanto, possedendo una spiccata affinità chimica con il Calcio, può essere rapidamente assorbito e si deposita nelle ossa nelle quali viene trattenuto (Torres et al., 2002). Le problematiche di carattere sanitario connesse all’accumulo di 90Sr nel tessuto osseo umano ed animale consistono nella possibile comparsa di osteosarcoma ed altre neoplasie. Inoltre, questo radionuclide può influenzare negativamente alcuni processi enzimatici e di trasporto nei quali è coinvolto il Calcio (Bronner et al., 1963).

Relativamente alla possibilità di accumulo di 90Sr nelle materie prime per mangimi e quindi nei prodotti finiti, tale rischio risulta particolarmente rilevante in relazione alla capacità di trasferimento del radionuclide fino ai prodotti alimentari di origine animale. Nelle zone particolarmente contaminate, il passaggio di radionuclidi (137Cs e 90Sr) dall’ambiente ai foraggi e da questi ai prodotti di origine animale (latte e carni bovine e suine) è stato più volte messo in evidenza da diversi studi effettuati dal disastro di Chernobyl ad oggi (Annenkov e Averin, 2011). Alcuni aspetti sono di particolare interesse. In particolare, nelle stesse condizioni di contaminazione radioattiva l’accumulo di 90Sr risulta molto maggiore rispetto a quello relativo al 137Cs. In uno studio, pubblicato nel 1998 (Fesenko et al., 1998), sono stati definiti inoltre dei coefficienti di passaggio piante-foraggio, sia per il 137Cs che per lo 90Sr, espressi come Bq/kg di piante/kBq/m2. Per lo 90Sr tali coefficienti variano da 4.52 per il frumento invernale a 8.50 per il mais, fino a 11.63 per le erbe graminacee-leguminose annue da foraggio. In condizioni di contaminazione media corrispondente a circa 1 kBq/m2 questi coefficienti di accumulo portano ad una concentrazione di attività di 90Sr, per singola unità foraggera, variabile da 1.3 Bq per l’orzo ed il grano, a 8.45 Bq per l’insilato di mais, fino a 33.7 Bq per le erbe graminacee leguminose pluriennali.

Dal punto di vista della contaminazione della filiera agroalimentare, la materia prima che risente maggiormente della contaminazione da 90Sr è senza dubbio il latte. Questo è dovuto, come già accennato in precedenza, alla spiccata similarità chimica di questo radioisotopo con il Calcio, elemento molto abbondante nel latte. Diversi studi hanno dimostrato che il passaggio di 90Sr nel latte è indipendente dal tipo di mangime utilizzato (fieno, leguminose, cereali) e che il contenuto finale può variare dallo 0.2 al 6.2% (Annenkov, 1964). Per questo motivo, il Regolamento (Euratom) No 2218/89 della Commissione Europea prevede controlli ufficiali sulla radiocontaminazione del latte, in caso di incidenti nucleari, e stabilisce i massimi limiti consentiti per la contaminazione da 90Sr. Tali limiti corrispondono a 125 Bq L–1 (o Bg kg–1) per il latte ed i prodotti lattiero caseari ed a 75 Bq L–1 per gli alimenti per l’infanzia (compreso il latte) (Commissione Europea, 1989).

L’accumulo di radiostronzio nei muscoli e negli organi risulta invece molto meno rilevante, dal momento che dopo la penetrazione nel sangue la maggior parte dei radionuclidi viene rimossa mediante gli organi escretivi o accumulata nello scheletro (Iammarino et al., 2013). Le concentrazioni residue nel muscolo risulteranno dunque esigue e variabili tra 0.011 Bq kg–1 per i bovini a 0.03 Bq kg–1 per i suini.

Per quanto riguarda le percentuali di accumulo nelle uova, essendo queste un prodotto di organi di escrezione, tali valori risultano non trascurabili. La percentuale di accumulo di 90Sr nelle uova può raggiungere l’1.4% del contenuto totale della razione giornaliera. In questo caso il potenziale di accumulo dello 90Sr risulta inferiore (circa la metà) rispetto a quello del 137Cs (Annenkov e Averin, 2011).

Attualmente, il Regolamento COM (2010)184 definitivo 2010/0098 della Commissione Europea non fissa dei limiti massimi consentiti per la contaminazione da 90Sr nei mangimi, definendo solo quelli relativi al 137Cs. Tali limiti sono stati invece definiti in altre regolamentazioni internazionali, come il Regolamento RDU-99 che in Bielorussia fissa alcuni limiti, come ad esempio 260 Bq kg–1 nel fieno, 185 Bq kg–1 nella paglia, 100 Bq kg–1 nell’erba e nel grano da foraggio, 50 Bq kg–1 nell’insilato, 137 Bq kg–1 nei tuberi e 37 Bq kg– 1 nell’erba verde (Repubblica della Bielorussia, 2001).

Risulta evidente, per quanto detto sinora, che il monitoraggio della contaminazione da 90Sr dei mangimi deve essere considerato un importante compito per gli organi preposti ai controlli sulla salute animale e sulla sicurezza alimentare. Da un punto di vista metodologico, la determinazione di 90Sr nelle matrici solide ha sempre presentato numerose problematiche analitiche, inerenti soprattutto la separazione radiochimica, dovute alla presenza di diversi cationi dalle caratteristiche chimicofisiche simili allo 90Sr (Ca, Pb, Bi, etc.) che rendono complesse e laboriose le varie procedure proposte, oltre che poco riproducibili. Inoltre, non sono mai state definite e sviluppate le necessarie procedure di validazione del metodo (Maxwell III e Culligan, 2009; Brun et al., 2003; Heilgeist, 2000; Kabai et al., 2011; Kim et al., 2009; Stamoulis et al., 2007; Wilken e Joshi, 1991; Vajda e Kim, 2010).

Nel presente lavoro viene, pertanto, presentata l’attività di sviluppo e validazione di un metodo radiochimico per la determinazione di 90Sr in varie tipologie di mangime per l’applicazione di questa tecnica nelle attività routinarie di controllo. La metodica analitica impiegata è stata la scintillazione liquida ad ultra basso fondo (LSC), tecnica che consente di effettuare la determinazione di concentrazioni di attività di 90Sr al di sotto di 0.01 Bq kg–1, dopo opportuno trattamento del campione (estrazione/purificazione/separazione del radioisotopo) e raggiungimento dell’equilibrio secolare 90Sr/90Y. L’affidabilità di questa procedura analitica è stata verificata mediante procedure di validazione implementate seguendo un protocollo sviluppato in-house, che consente di determinare le più importanti performances analitiche in accordo con gli attuali riferimenti legislativi (Commissione Europea, 2002, 2004).

Materiali e Metodi

Del campione ne vengono inceneriti 250 g in muffola secondo la rampa di temperatura mostrata in Figura 1. Le ceneri vengono disciolte in una miscela HNO3 8M/HF al 50% e viene aggiunto 1 mL di carrier (Sr stabile 10,000 mg L–1). Viene effettuata una lisciviazione della miscela a 300°C, quindi una filtrazione e l’aggiunta di acido ossalico anidro e sodio acetato. L’aggiunta di acido ossalico consente di precipitare lo Stronzio presente nel campione come ossalato e di separarlo da altri metalli affini, una volta corretto il pH della soluzione a 4.5 mediante aggiunta di NH4OH al 30%. Il precipitato viene quindi disciolto con una miscela H2O2/HNO3 8M e la soluzione viene portata a secco. Il residuo viene disciolto in HCl 0.5 M e si aggiungono altri 4 volumi di H2O. Successivamente viene effettuata la rimozione di altri due importanti interferenti radiometrici, il 210Pb ed il 210Bi mediante precipitazione, sotto forma di solfuro, aggiungendo 1 mL dei rispettivi standard di carrier stabili (10,000 mg L–1) e circa 50 mg di sodio solfuro. II precipitato formatosi viene rimosso mediante filtrazione con carta bibula, il pH del filtrato viene corretto ad 1.0 per rimuovere l’90Y eventualmente presente, mediante complessazione con acido etil-esil ortofosforico (HDEHP), effettuando una doppia aggiunta di una soluzione di HDEHP al 20% in toluene, agitazione vigorosa ed eliminazione della fase organica. La fase acida viene portata a volume (200 mL) con HCl 0.1 M e posta a temperatura ambiente fino al raggiungimento dell’equilibrio secolare 90Sr/90Y (min. 15 gg).

Quindi si procede con la separazione dell’90Y per la determinazione radiochimica. Viene aggiunto 1 mL di carrier Yttrio stabile 10000 mg L-1, il pH della soluzione viene corretto a 1.0 e si procede con la separazione dell’90Y eventualmente presente mediante complessazione con HDEHP, ovvero aggiungendo 200 mL di una soluzione di HDEHP al 5% in toluene, agitando vigorosamente e recuperando la fase organica che viene quindi lavata due volte con HCl 0.1M. L’estrazione finale dell’90Y dalla soluzione si ottiene mediante separazione liquidoliquido utilizzando due aliquote da 150 mL di HNO3 3 M. L’90Y, estratto nella fase acida, viene quindi precipitato come ossalato aggiungendo acido ossalico all’8%, correggendo il pH a 2.5 mediante aggiunta di NH4OH al 15% e riscaldando la soluzione fino ad ottenere abbondante precipitato bianco. Il precipitato viene filtrato, disciolto in una miscela HNO3/H2O2, portato a secco, quindi ridisciolto con HCl ed essiccato nuovamente. Il residuo finale viene ripreso con 8 mL di acido cloridrico 0.1 N, trasferito in apposita vial dove viene aggiunto il cocktail di scintillazione (Ultima Gold AB; Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). La lettura LSC è stata effettuata mediante scintillatore liquido ad ultra basso fondo (Wallac 1220 Quantuls; Perkin Elmer) impostato con un tempo di conteggio di 1000 minuti.

Il metodo è stato sottoposto ad una procedura di validazione su matrici alimentari solide (carni fresche e prodotti della pesca), implementata seguendo un approccio validativo in-house per verificare l’affidabilità del metodo allo scopo preposto. Sono stati verificati i seguenti parametri: selettività, linearità, precisione, recupero, efficienza di conteggio, robustezza ed incertezza di misura. Il decision threshold e il detection limit sono stati calcolati in accordo con la norma ISO 11929:2010 (ISO, 2010); la selettività è stata valutata mediante prove ripetute di fortificazione e verificando la forma dello spettro ed i conteggi totali; la linearità è stata verificata mediante conteggio di tre sorgenti di attività pari a 1.5, 95.48 e 494,40 Bq; l’accuratezza è stata verificata effettuando prove di fortificazione ripetute (n=6) in condizioni di ripetibilità intermedia, a due livelli di concentrazione di attività pari a 0,5 e 1.0 Bq kg–1; infine, l’efficienza di conteggio e la minima concentrazione di attività rivelabile sono state valutate trattando tre sorgenti di 90Sr, di attività pari a 1.0 Bq, con la stessa procedura di separazione dell’Yttrio utilizzata per i campioni (Iammarino et al., 2012).

Al fine di estendere il campo di applicazione ai mangimi, e considerando che tale tipologia di campione è caratterizzata da concentrazioni di attività di 90Sr non trascurabili, 6 tipologie diverse di mangime e materie prime per mangimi sono stati analizzate; quindi, sugli stessi campioni, sono state effettuate prove di fortificazione a 1.0 Bq kg–1.

Il metodo così ottimizzato e validato è stato impiegato per condurre un monitoraggio della contaminazione da 90Sr su 32 campioni di foraggi e mangimi (18 insilati, 7 fieni e 7 mangimi).

Risultati e Discussione

Il metodo radiochimico validato in questo studio ha mostrato diversi aspetti che lo rendono preferibile rispetto ad altri attualmente disponibili (Maxwell III e Culligan, 2009; Brun et al., 2003; Heilgeist, 2000; Kabai et al., 2011; Kim et al., 2009; Stamoulis et al., 2007; Wilken e Joshi, 1991; Vajda e Kim, 2010).

La specifica serie di precipitazioni e purificazioni garantisce la separazione radiochimica dello 90Sr da altri isotopi ed interferenti; inoltre, la tecnica LSC consente di registrare spettri sia di particelle alfa che beta con una efficace discriminazione delle sorgenti di emissione. La tecnica LSC fornisce, inoltre, valori di efficienza di conteggio (0.87), di decision threshold (0.003 Bq kg–1) e di detection limit (0.008 Bq kg–1) più efficienti rispetto alle tecniche tradizionali. In Figura 2 è mostrato il caratteristico spettro di emissione beta dell’Yttrio-90.

Altri importanti parametri di validazione (Tabella 1) che caratterizzano il metodo sono la linearità (r2=0.9987), il recupero medio (92 e 89%), il coefficiente di variazione percentuale (14 e 15%) per livelli di additivazione pari rispettivamente a 0.5 Bq kg–1 e 1.0 Bq kg-1, l’incertezza di misura, pari al 16.0% e la robustezza, valutata in condizioni di major changes, ovvero variando la matrice da analizzare, caratterizzata da un campo di applicazione composto da carni fresche (bovine, suine ed ovi-caprine), prodotti carnei (insaccati e prosciutti), prodotti ittici (molluschi bivalvi, cefalopodi e teleostei), prodotti lattiero caseari (mozzarella, ricotta e formaggi a breve e lunga maturazione), grano e prodotti derivati del grano (pane e pasta). È importante ricordare che, al fine di verificare ulteriormente l’accuratezza del metodo è stato analizzato un materiale di riferimento (IAEA 152: coriandolo). Tale materiale di riferimento, caratterizzato da un valore certificato di concentrazione di attività dello 90Sr pari a 7,7 Bq kg–1 alla data del 31 Agosto 1987, ha fatto registrare un valore medio di concentrazione di attività di 90Sr pari a 7.16±1.67 Bq kg–1 (P=95%, k=2). Tenuto in considerazione l’intervallo di accettabilità, dichiarato sullo stesso materiale di riferimento certificato (7.0÷8.3 Bq kg–1 ad un livello di confidenza del 95%), si è potuta confermare l’attendibilità dell’intera procedura analitica.

La sessione supplementare di validazione, relativa all’estensione del campo di applicazione ai mangimi, ha portato ai risultati riassunti nella Tabella 2. Le contaminazioni registrate nelle varie tipologie di mangime sono risultate molto variabili (da 0.23 Bq kg–1 relativa al mangime per conigli, a 1.61 Bq kg–1 relativa al mangime complementare minerale), tuttavia non è possibile trarre conclusioni relativamente alla relazione tra entità della contaminazione e tipo di mangime a causa del basso numero di campioni analizzati non statisticamente significativo. Futuri studi, già in fase di progettazione, andranno ad approfondire e definire l’eventuale specificità nella contaminazione da 90Sr nelle varie tipologie di mangime.

Per quanto riguarda le prove di fortificazione, i risultati hanno confermato l’estrema versatilità e robustezza del metodo validato. La percentuale media di recupero è risultata infatti pari al 90% (recupero medio di validazione al livello 1.0 Bq kg-1=89%) con un coefficiente di variazione percentuale pari a 14.3% (CV% di validazione al livello 1.0 Bq kg– 1=15%). In Figura 3 sono riportati i confronti tra gli spettri relativi alle varie tipologie di mangime testate, analizzate prima e dopo la fortificazione con 90Sr.

Il monitoraggio su campioni di foraggi e mangimi ha confermato la necessità di un controllo radiochimico, soprattutto per quanto concerne le materie prime, in quanto su tutti i campioni è stata verificata una contaminazione da 90Sr ben superiore al detection limit (0.008 Bq kg–1) del metodo (Tabella 3).

In particolare, i campioni di fieno hanno fatto registrare la concentrazione di attività media di 90Sr più elevata (2.93 Bq kg–1); questo è in accordo con quanto definito dal Regolamento Bielorusso RDU-99 che fissa il limite massimo di contaminazione a 260 Bq kg–1 nel fieno ed a 50 Bq kg–1 nell’insilato. Tale netta differenziazione nella stima del limite massimo di contaminazione è, probabilmente, dovuta alla percentuale di sostanza secca che caratterizza queste due tipologie di matrice, ovvero 85% circa nel fieno e 40% circa nell’insilato.

La concentrazione di attività media registrata nei mangimi è risultata la più bassa (0.77 Bq kg–1) ed anche questo dato è sostanzialmente in accordo con quanto ad oggi disponibile in letteratura. Infatti, attualmente, non sono stati definiti limiti massimi ammissibili per la contaminazione da 90Sr nei mangimi e ciò è essenzialmente dovuto al fatto che, secondo i dati presenti in letteratura scientifica, questa matrice non ha mostrato particolari capacità di accumulo di tale radionuclide.

Infine, grazie all’analisi statistica dei dati ottenuti (F-test a due campioni per varianze), è stato possibile verificare una omogeneità dei dati tra i campioni di fieno e quelli di insilato, mentre i campioni di mangimi sono risultati contaminati a livelli statisticamente inferiori.

Conclusioni

Il metodo radiochimico descritto in questo studio, validato per la determinazione di radionuclidi beta emittenti (90Sr) nei mangimi presso il Centro di Referenza Nazionale per la Ricerca della Radioattività nel Settore Zootecnico-Veterinario (Foggia), ha mostrato diversi aspetti (selettività, sensibilità e robustezza) che lo rendono preferibile rispetto ad altri attualmente disponibili. Inoltre, le prove di validazione hanno permesso di verificare l’idoneità allo scopo di tale metodica grazie alla valutazione delle più importanti performance analitiche: selettività, sensibilità, linearità, accuratezza e robustezza.

Per quanto concerne il monitoraggio su campioni di foraggi e mangimi, tale lavoro ha permesso di confermare la necessità di controlli di tipo radiochimico, relativi alla contaminazione da 90Sr, soprattutto per quanto concerne le materie prime. Infatti su tutti i campioni è stata verificata una contaminazione da 90Sr ben superiore al detection limit (0.008 Bq kg–1) del metodo. In particolare, i campioni di fieno hanno fatto registrare la concentrazione di attività media di 90Sr più elevata (2.93 Bq kg– 1), seguita da quella relativa ai campioni di insilato (2.07 Bq kg–1) e da quella relativa ai campioni di mangime (0.77 Bq kg–1).

Tabella 1.

Principali parametri di validazione del metodo.

Parametro	Valore
Efficienza di conteggio	0.87
Decision threshold (Bq kg–1)	0.003
Detection limit (Bq kg–1)	0.008 Bq kg–1
Linearità (r2)	0.9987
Recupero (%)	92 (livello 0.5 Bq kg–1) - 89 (livello 1.0 Bq kg–1)
Precisione (CV%)	14 (livello 0.5 Bq kg–1) - 15 (livello 1.0 Bq kg–1)
Incertezza di misura (%)	16.0

CV, coefficiente di variazione.

Tabella 2.

Risultati di validazione per la matrice mangimi.

Tipo di campione	Concentrazione di attività (Bq kg–1)	Concentrazione di attività campione additivato (1.0 Bq kg–1)	Concentrazione di attività finale (additivato-blank) (Bq kg–1)	Recupero medio	CV%
Mangime per conigli	1.61	2.34	0.73	90%	14.3
Sfarinato orzo-avena-fave	0.67	1.47	0.80
Mangime per vitelli	0.37	1.43	1.06
Mangime per cavalli	0.63	1.60	0.97
Mangime complementare minerale	0.23	1.07	0.84
Mangime per acquacoltura	0.57	1.57	1.00

CV, coefficiente di variazione.

Tabella 3.

Risultati del monitoraggio.

Tipo di campione	Campioni analizzati (n)	Range di concentrazione di attività misurata (Bq kg–1)	Concentrazione di attività media (Bq kg–1)
Fieno	7	0.24-5.48	2.93
Insilato	18	0.28-6.11	2.07
Mangime	7	0.23-1.61	0.77