Microbiological Findings in Ready-to-Eat and Precooked Food Distributed in Public Catering Halls in Cagliari Province, Italy.

During this research 159 samples of ready-to-eat and precooked food were examined for the detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, Escherichia coli, coagulase-positive staphylococci and Enterobacteriaceae, bacterial count. All samples were negative for Salmonella spp. and Listeria monocytogenes; although a low count of coagulase-positive staphylococci (no. 5 samples) and E. coli (no. 3) was found. We proceeded with the identification of the isolates on every sample with high, moderate and low-count of Enterobacteriaceae, to better understand the microbial ecology. The Enterobacteriaceae species most frequently detected were Pantoea spp. (29.62%), Enterobacter cloacae (20.37%) and Serratia liquefaciens (12.96%); other different species of Enterobacteriaceae were detected with a <10% presence. Since there are no legal regulations indicating tolerance or limit values or this kind of microorganisms related to the samples, it would be appropriate, in the presence of high count of Enterobacteriaceae or by type of ready-to-eat and precooked food, to proceed with the identification of every microorganism.

Introduzione

Nel periodo aprile 2012-aprile 2013 sono stati analizzati presso il Laboratorio di Microbiologia degli alimenti del Dipartimento di Cagliari dell’Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sardegna (IZS Sardegna)

159 campioni di piatti pronti e precotti, prelevati dal Servizo Igiene degli Alimenti e della Nutrizione (SIAN). I campioni sono stati suddivisi nelle seguenti tipologie alimentari: i) preparazioni gastronomiche precotte, ii) preparazioni gastronomiche cotte e spuntini, iii) insalate di mare, iv) dolci e dessert, v) insalate e ortaggi, vi) salse e sughi, vii) frutta e succhi, come riportato in un precedente lavoro (Nyenje et al., 2012). In tutti i campioni sono stati determinati i seguenti parametri microbiologici: Listeria monocytogenes (n. 118 campioni), Salmonella spp. (n. 131), Enterobacteriaceae (n. 130), Escherichia coli (n. 133), stafilococchi coagulasi positivi (n. 124), microrganismi mesofili aerobi (n. 10).

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di acquisire informazioni per valutare la qualità microbiologica in campioni di piatti pronti e precotti, provenienti dalla ristorazione pubblica e collettiva distribuiti nel territorio della provincia di Cagliari e di approfondire lo studio di alcune specie batteriche presenti in elevata o moderata carica.

Materiali e Metodi

La ricerca di Listeria monocytogenes è stata effettuata secondo la Norma UNI EN ISO 11290-1:2005 (UNI, 2005); la ricerca di Salmonella spp. è stata effettuata secondo la Norma ISO 6579:2008 (ISO, 2008); la ricerca di Enterobacteriaceae è stata effettuata secondo la Norma ISO 21528-2:2004 (ISO, 2004); la ricerca di E. coli è stata effettuata secondo la Norma 16649-2:2001 (ISO, 2001); la ricerca di stafilococchi coagulasi positivi è stata effettuata secondo la norma UNI EN ISO 6888-2:2004 (UNI, 2004); la ricerca di mesofili aerobi è stata effettuata secondo la Norma ISO 4833:2003 (ISO, 2003). Per l’identificazione di specie sono stati utilizzati tests biochimici e gallerie miniaturizzate. In particolare, per l’identificazione delle Enterobacteriaceae è stata effettuata la colorazione di Gram e il test dell’ossidasi. Per l’identificazione di specie delle Enterobacteriaceae sono state utilizzate le gallerie API 20E (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia). Per l’analisi statistica i valori UFC/g sono stati convertiti in log10; i valori numerici delle Enterobacteriaceae ottenuti nelle tipologie alimentari sottoposte ad analisi, sono stati comparati mediante analisi della varianza a una via (one-way ANOVA) seguito da un test di comparazione multipla di Tukey. L’analisi statistica è stata eseguita con SPSS versione 15.0 e sono stati considerati significativi i valori con P<0,05.

Risultati

Tutti i campioni sono risultati negativi per Salmonella spp. (n. 131) e per Listeria monocytogenes (n. 118). In 5/124 e 3/133 campioni analizzati rispettivamente per stafilococchi coagulasi positivi e E. coli è stata riscontrata una carica accettabile secondo i parametri stabiliti dal Reg. (CE) n. 2073 del 2005 (Commissione Europea, 2005) e successive modifiche. Per meglio comprendere l’ecologia microbica nei campioni con una carica di Enterobacteriaceae >10 UFC/g (n. 54 campioni), si è proceduto alla identificazione degli isolati. Enterobacter spp. (31,5%) è risultato il genere prevalente; le specie identificate sono risultate essere Enterobacter cloacae (20,37%), Enterobacter agglomerans (5,55%), altri (5,55%) mentre, Pantoea spp. e Serratia spp. rappresentano rispettivamente il 29,6% e il 16,6% degli isolati (Tabella 1). Un valore elevato di Klebsiella pneumonie (2,4x106 ufc/g) è stato accertato in un campione di insalata di mare. L’analisi della varianza ha evidenziato una significatività statistica tra i valori delle Enterobacteriaceae (log10 UFC/g); il test di comparazione multipla (Tukey) ha dettagliato le tipologie di alimenti differenti tra loro (P<0,05) (Tabella 2).

Tabella 1.

Enterobacteriaceae: specie isolate da piatti pronti e precotti.

Specie	% sul totale delle colonie identificate
Pantoea spp.	29,62
Enterobacter cloacae	20,37
Serratia liquefaciens	12,96
Klebsiella oxytoca	9,25
Enterobacter agglomerans	5,55
Hafnia alvei	5,55
Enterobacter spp. (aerogenes, amnigenus, sakazakii)	5,55
Routella spp.	5,55
Klebsiella pneumoniae	3,70
Serratia spp. (rubidaea, funticola)	3,70
Citrobacter spp.	3,70
Altre specie	11,11

Tabella 2.

Enterobacteriaceae in piatti pronti e precotti: statistiche descrittive e comparazione multipla (test Tukey).

Tipologia di alimento	Range Enterobacteriaceae (log10 UFC/g)	Media±DS Enterobacteriaceae (log10 UFC/g)	P
				PPC	PC	IM	D	IO	S	F
PPC	<1,0-5,7	2,18±2,35		-	0,882	0,814	0,935	0,844	0,964	0,704
PC	<1,0-5,6	1,41±0,92		0,882	-	0,000	1,000	0,000	1,000	0,978
IM	<1,0-6,6	3,08±1,89		0,814	0,000	-	0,003	1,000	0,005	0,002
D	<1,0-3,7	1,44±0,83		0,935	1,000	0,003	-	0,006	1,000	0,986
IO	<1,0-5,0	3,05±1,08		0,844	0,000	1,000	0,006	-	0,010	0,004
S	<1,0-4,5	1,53±1,13	0,964	1,000	0,005	1,000	0,010	-	0,961
F	<1,0-1,0	1,00±0,00	0,704	0,978	0,002	0,986	0,004	0,961	-

DS, deviazione standard; PPC, preparazioni gastronomiche precotte; PC, preparazioni gastronomiche cotte e spuntini; IM, insalata di mare; D, dolci e dessert; IO, insalate e ortaggi; S, salse e sughi; F, frutta e succhi.

Discussione

Dai risultati ottenuti in relazione alla qualità microbiologica si riscontra una assenza di microrganismi patogeni quali Salmonella spp. e Listeria monocytogenes mentre, per quanto riguarda le Enterobacteriaceae le cariche più elevate sono state riscontrate nelle insalate di mare (3,08±1,89 log10 UFC/g) e nelle insalate fresche e ortaggi (3,05±1,08 log10 UFC/g). Questi valori sono risultati significativamente più alti rispetto alle altre tipologie alimentari ad eccezione delle preparazioni gastronomiche precotte che presentano un valore di 2,18±2,35 log10 UFC/g. Il dato non risulta significativamente differente (P>0,05). Le restanti tipologie alimentari hanno presentato medie dei valori compresi tra 1,00 e 1,53 log10 UFC/g; queste categorie risultano non significativamente differenti fra loro e con le PPC.

Tra le Enterobacteriaceae isolate, il genere prevalente è rappresentato da Pantoea spp., riscontrato in diverse tipologie di alimenti di cui circa il 50% nelle insalate di verdure. Recenti studi dimostrano che Pantoea spp. è uno fra gli endofiti naturalmente presente nelle piante per cui, dai dati raccolti, si può ritenere che tale microrganismo appartenga alla flora batterica naturale presente nelle verdure (Houa et al., 2013). La categoria insalate e ortaggi rappresenta la tipologia di prodotti alimentari maggiormente contaminati da Enterobacter cloacae. Tale dato è sovrapponibile ai risultati ottenuti da Falomir et al. (2010). Come riportato in letteratura (Jay et al., 2011), tale microrganismo è inserito tra gli otto batteri Gram-negativi che possiedono almeno un fattore di virulenza spesso associato a patogeni alimentari. I valori delle Enterobacteriaceae nei piatti precotti presentano un range elevato (Tabella 2), ma trattandosi di alimenti per i quali il trattamento termico riduce il valore della carica batterica, tale categoria di alimento non costituisce un rischio per il consumatore. Non è da sottovalutare tuttavia, la possibile presenza di alcune enterotossine termostabili prodotte da alcuni microrganismi come Enterobacter cloacae, Klebsiella pneumoniae (Jay et al., 2011) per i quali l’azione del calore risulta inefficace. Il piatto pronto insalata di mare è costituito da un prodotto base che comprende diverse specie ittiche cotte, verdure crude, ortaggi e spezie. Il prodotto base è presumibilmente privo di elevate cariche batteriche poiché sottoposto a cottura ma, l’aggiunta di verdure crude e spezie, può rappresentare una possibile fonte di contaminazione del prodotto finito. Le Enterobacteriaceae rappresentano un parametro inserito tra i criteri di igiene di processo [Reg. (CE) n. 2073 del 2005 e successive modifiche; Commissione Europea, 2005] con valori di riferimento associati. Nel caso in cui si effettui la ricerca di Enterobacteriaceae su matrici non inserite nel corpus legislativo, l’interpretazione del dato analitico è difficoltosa e la mancanza di valori di riferimento implica un confronto quasi esclusivo con la bibliografia scientifica.

Conclusioni

Sarebbe opportuno, in presenza di una carica medio alta e in assenza di valori di riferimento, procedere all’identificazione per la valutazione del rischio legato alla specie. A tutt’oggi, sulla base del risultato, l’autorità competente effettua le opportune verifiche sul processo di produzione e sulle misure messe in atto dall’operatore del settore alimentare. È auspicabile che, a livello regionale, si elabori un protocollo tecnico che preveda dei valori guida in relazione alla matrice e al risultato analitico, al fine di una migliore interpretazione e gestione del dato da parte degli enti interessati.