Introduzione

La listeriosi è una tossinfezione alimentare causata da Listeria monocytogenes. Le forme invasive di listeriosi umana includono setticemia, meningiti e infezioni materno-fetali (Lorber, 1997). Molti paesi hanno organizzato un sistema di sorveglianza per L. monocytogenes a causa della sua importanza per la salute umana ma anche perché il suo controllo è una grossa sfida per le aziende alimentari. La tipizzazione di L. monocytogenes a livello di ceppo viene utilizzata nelle attività di sorveglianza, negli studi epidemiologici e durante gli episodi tossinfettivi (Kathariou, 2002; Swamina - than e Gerner-Smidt, 2007). Studi filogenetici hanno identificato nella popolazione di L. monocytogenes 4 distinte linee filogenetiche delle quali le linee 1 e 2 contengono genotipi più importanti per la loro patogenicità per l’uomo (Kathariou, 2003; Nightingale et al., 2005; Orsi et al., 2011; Piffaretti et al., 2008; Ward et al., 2010). Per identificare tali genotipi e le loro fonti di contaminazione sono necessarie metodiche di tipizzazione standardizzate; tra tali metodiche, la sierotipizzazione (Seeliger e Höhne, 1979) e la polymerase chain reaction (PCR) sierotipizzazione (Doumith et al., 2004), sebbene largamente utilizzate per la caratterizzazione di L. monocytogenes non sono abbastanza discriminanti da poter essere impiegate nel contesto di un’analisi epidemiologica durante un focolaio di tossinfezione alimentare. L’elettroforesi in campo elettrico pulsato (PFGE) ha rappresentato per anni la metodica di riferimento per la tipizzazione di L. monocytogenes ed è ancora ampiamente utilizzata per le attività di sorveglianza e le analisi epidemiologiche (Graves e Swaminathan, 2001). Tuttavia, la sua esecuzione è molto laboriosa e richiede una notevole standardizzazione. Inoltre, è scarsamente riproducibile tra laboratori diversi. La multi-locus sequence typing (MLST) è la tecnica attualmente più utilizzata per le analisi epidemiologiche e lo studio delle popolazioni. Infatti, il profilo MLST può essere facilmente confrontato tra laboratori diversi e il dato fornito, basato sul sequenziamento, è correlabile al livello di diversità genetica ed alla frequenza di ricombinazione tra ceppi (Feil, 2004; Maiden, 2006). Tuttavia, la MLST è una metodica lunga, costosa e per L. monocytogenes ha un potere discriminatorio limitato (Ragon et al., 2008; den Bakker et al., 2010).

Per superare le limitazioni associate alle tecniche descritte un approccio alternativo è rappresentato dall’analisi multilocus del numero variabile di sequenze tandem (MLVA) già utilizzata per le analisi epidemiologiche di altri batteri patogeni (Lindstedt, 2005) perchè è relativamente semplice, economica e dotata di un buon potere discriminatorio. La metodica MLVA si basa sullo studio della variabilità del numero di sequenze tandem in specifici loci del genoma batterico. Cinque schemi MLVA sono stati simultaneamente sviluppati per la tipizzazione di L. monocytogenes ed il loro impiego è già stato dimostrato in vari studi epidemiologioci (Balandyte et al., 2011; Chen et al., 2011; Houhoula et al., 2012; Li et al., 2013; Lunestad et al., 2012). I cinque schemi si differenziano per il numero di multiple locus variable number of tandem repeats (VNTR) considerato, variabile da 3 a 10.

La carne di maiale è la tipologia di carne fresca più consumata in Europa (Devine, 2003) ed il suo controllo in termini di contaminazione con microrganismi patogeni è fondamentale sia per la salute pubblica sia per le aziende alimentari. In questo studio una metodica MLVA basata sull’analisi di 6 loci VNTR è stata utilizzata per tipizzare un gruppo di 82 ceppi di L. monocytogenes, isolati da 8 lotti di carne di maiale testati dal momento del confezionamento al consumo, per valutarne la diversità e potenziale patogenicità per l’uomo in funzione della appartenenza alle linee filogenetiche note per L. monocytogenes.

Materiali e Metodi

Otto lotti di lonza di maiale sono stati campionati da Dicembre 2010 a Ottobre 2011 nello stesso laboratorio di sezionamento. In ogni lotto, la presenza/assenza di L. monocytogenes è stata valutata in 20 unità campionarie utilizzando la metodica ISO11290-1:1996/Amd1: 2004 (ISO, 2004). Le 20 unità campionarie sono state suddivise come segue: 5 sono state analizzate dopo il confezionamento sotto vuoto; 5 dopo trasporto in automezzo refrigerato aziendale e stoccaggio nel banco frigo presente nel punto vendita fino al quarto giorno post confezionamento; 5 dopo trasporto e stoccaggio al punto vendita, trasporto per 45 min in auto senza refrigerazione e stoccaggio a 6°C fino al termine della shelf life del prodotto al giorno sette post-confezionamento; 5 dopo trasporto e stoccaggio al punto vendita, trasporto per 45 min in auto senza refrigerazione e stoccaggio a 14°C fino al giorno sette post-confezionamento.

Da 3 a 15 isolati sono stati selezionati a caso dai campioni positivi appartenenti ad uno stesso lotto, purificati mediante tre passaggi seriali in piastre di Brain Heart Infusion Agar (Oxoid, Milano, Italy) incubate a 37°C per 24 ore, identificati come L. monocytogenes o Listeria spp. con PCR mediante il protocollo di Wesley et al. (2001). Gli isolati identificati come L. monocytogenes sono stati genotipizzati mediante MLVA. Un totale di 6 VNTR sono stati ottimizzati per l’amplificazione in due distinte multiplex-PCR. I prodotti di reazione sono stati diluiti e miscelati in una mix contenente formammide e Genescan 600 Liz come marcatore di peso molecolare. Le corse elettroforetiche sono state eseguite mediante 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). I dati sono stati analizzati mediante GeneMapper 4.0 (Applied Biosystems), i singoli alleli normalizzati, importati in Bionumerics 6.5 (Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium) ed utilizzati per l’analisi filogenetica.

Risultati

Tutte le tipologie di campioni analizzate sono risultate positive per L. monocytogenes. Tuttavia, i dati di prevalenza e concentrazione del patogeno nei campioni testati sono fuori dallo scopo di questo lavoro.

Complessivamente sono stati tipizzati mediante MLVA 82 ceppi isolati da prodotti al momento del confezionamento (N=16), dopo trasporto e stoccaggio al punto vendita (N=21) e dopo stoccaggio fino al giorno sette post-confezionamento a 6 (N=22) o 14°C (N=23) (Tabella 1). Nel lotto 1, gli isolati analizzati con MLVA sono stati raccolti fino al giorno 4 post confezionamento mentre nei lotti 7 ed 8 da quel momento in poi. Al contrario, negli altri cinque lotti i ceppi da tipizzare sono stati raccolti dal confezionamento al consumo. I ceppi analizzati erano classificati in 10 profili MLVA siglati da I a X, contenenti ognuno un numero di isolati variabile da 1 a 20 (Tabella 1). I lotti 1 e 3 sono stati caratterizzati da isolati con il medesimo profilo MLVA, mentre i restanti 6 lotti hanno mostrato profili MLVA diversi durante la shelf-life. In particolare, in tutti i lotti è stato osservato un profilo MLVA persistente (es. profilo III nel lotto 2, VII nel lotto 4, VIII nei lotti 5 e 6, VII nel lotto 7 e parzialmente II nel lotto 8) e profili MLVA associati a fasi specifiche.

Tabella 1.

Profili dell’analisi multilocus del numero variabile di sequenze tandem associati agli isolati testati.

Lotto	Data	Profilo MLVA (n. isolati)			t=7 giorni (14°C)
		t=0 giorni	t=4 giorni	t=7 giorni (6°C)
1	Dicembre 2010	VII (2)	VII (1)	-	-
2	Gennaio 2011	III (1)VIII (1)	III (1)VIII (2)	III (1)IV (2)	III (2)VII (2)
3	Febbraio 2011	VII (3)	VII (4)	VII (4)	VII (4)
4	Aprile 2011	VII (4)	VII (3)VI (1)	VII (3)X (1)	VII (4)
5	Maggio 2011	VIII (2)	VIII (2)	VIII (4)VII (1)	VIII (3)
6	Agosto 2011	VIII (1)V (1) IX (1)	VIII (1)V (3)	VIII (1)V (2)	VIII (1)V (2)I (1)
7	Settembre 2011	-	VII (1)	VII (2)	VII (1)VIII (1)
8	Ottobre 2011	-	II (1)VIII (1)	II (1)III (1)	V (1)
Totale		16	21	22	23

MLVA, analisi multilocus del numero variabile di sequenze tandem.

Come osservato in studi precedenti, i profili MLVA consentono, con una notevole affidabilità, di prevedere la linea filogenetica, il sierotipo ed il sequence type (ST) degli isolati analizzati. In questo studio, i profili MLVA dal VI al X identificati nel 75.6% degli isolati testati indicano l’appartenenza di tali ceppi alla linea filogenetica 2 ed al sierotipo 1/2c, spesso associato a ceppi isolati da alimenti ma non dall’uomo. Al contrario, 3 isolati con profili MLVA I e IV risultano appartenere alla linea filogenetica 1 e sierotipo 4b, spesso identificato in ceppi responsabili di episodi di infezione umana. Infine, 17 isolati con profili MLVA II, III e V risultano associabili linea filogenetica 2 ed al sierotipo 1/2a, anch’esso tipico di ceppi responsabili di infezione umana.

Discussione

L. monocytogenes è uno dei patogeni frequentemente associati al consumo di carne di maiale come dimostrato da Fosse e collaboratori (2008); inoltre, Matargas e collaboratori (2008) hanno confermato la relazione tra il rischio di contrarre listeriosi ed il consumo di carne di maiale poco cotta o processata e da riscaldare prima del consumo. Sulla base di queste considerazioni la carne di maiale cruda, come quella analizzata in questo studio, può essere fonte di contaminazioni crociate e pertanto il suo controllo diventa rilevante in termini epidemiologici. Per capire il livello di rischio associato ad un prodotto alimentare contaminato con L. monocytogenes è importante capire come cambia la popolazione del patogeno durante la vita commerciale del prodotto. Alcune delle fasi che impattano non solo sulla sopravvivenza e moltiplicazione di L. monocytogenes nella carne fresca ma anche sulla composizione della popolazione contaminante sono la fase di manipolazione nel laboratorio di sezionamento; il trasporto e lo stoccaggio del prodotto confezionato nel punto vendita; il trasporto da parte del consumatore dal punto vendita a casa e lo stoccaggio in frigorifero prima del consumo. In questa ricerca l’impatto della fase di stoccaggio in frigorifero da parte del consumatore è stato valutato considerando come temperatura media dei frigoriferi di casa 6°C e come temperatura media di abuso 14°C.

La tecnica MLVA si distingue da altre metodiche di tipizzazione utilizzate per L. monocytogenes, come la sierotipizzazione, la PFGE e la MLST, per la notevole processività e per i costi contenuti di esecuzione. Inoltre, è facilmente standardizzabile e riproducibile tra laboratori, garantendo la possibilità di confrontare gli isolati con un sistema univoco di interpretazione. I risultati ottenuti in questo studio preliminare hanno dimostrato che in funzione del profilo MLVA la maggior parte degli isolati testati ricadeva in un genotipo raramente coinvolto in episodi clinici. Tuttavia, i tre ceppi classificati nei profili MLVA I e IV potrebbero essere altamente patogeni perché associati alla linea filogenetica 1 e sierotipo 4b, ed anche i profili MLVA II, III e V del sierotipo 1/2a andrebbero ulteriormente caratterizzati a causa dell’incremento atteso delle segnalazioni relative al coinvolgimento di tali isolati in focolai di listeriosi anche nel nostro paese (Mammina et al., 2013). Anche se la loro presenza nel prodotto post confezionamento non può essere esclusa per il basso numero di isolati tipizzati, è interessante notare come queste tipologie di ceppi compaiano alla fine della shelf life del prodotto. La maggior parte dei profili MLVA persistenti nei lotti analizzati non sembrano associabili a sierotipi altamente patogeni per l’uomo ma la loro coesistenza con ceppi potenzialmente patogeni è stata osservata nei lotti 2, 6 e 8. Questo risultato dimostra che la corretta valutazione del numero di ceppi da sottoporre a tipizzazione è fondamentale per consentire una corretta mappatura della popolazione del patogeno.

Conclusioni

La tecnica di MLVA applicata in questo studio riteniamo possa rappresentare un valido strumento diagnostico specialmente nello studio di situazioni epidemiologiche complesse, come possono essere gli stabilimenti di produzione, in cui spesso diverse popolazioni della stessa specie possono convivere e contaminare gli alimenti, ma soprattutto quando vi sia la necessità di collegare tra loro diversi episodi clinici o questi alle rispettive fonti di contaminazione. In questo studio l’applicazione dell’MLVA ha permesso di identificare nel prodotto al momento del consumo tre ceppi potenzialmente patogeni per l’uomo con sierotipo 4b in due dei lotti analizzati, confermando la necessità di caratterizzare geneticamente i ceppi di L. monocytogenes al fine di una efficace valutazione del rischio.