[Effects of DNA methylation on ABO gene expression in leukemia].

Objective: To investigate the impact of promoter CpG island methylation on ABO mRNA expression in leukemia.
Methods: 25 cases of leukemia and 20 cases of normal control were studied, and the leukemia cell lines K562、HL-60 and Jurkat were treated with different concentrations of decitabine. PCR-SSP was used to identify ABO genotype, RQ-PCR for ABO mRNA expression and bisulfite sequencing PCR for DNA methylation status.
Results: ① The methylation of ABO promoter in acute myeloid leukemia patients (10 cases) and acute lymphoblastic leukemia patients (10 cases) were 53.85% and 18.22% respectively, which were obviously higher than those in control (20 cases, 2.33%) and chronic myeloid leukemia patients (5 cases, 2.12% ). ② ABO genotype of K562 was O1O1, which has changed little before and after decitabine treatment. ABO genotype of HL-60 and Jurkat could not been identify before treatment, but showed as O1A1 and A1O2 after treatment. ③ABO mRNA expression of K562 was 1 275.67 ± 35.86, which was obviously higher than that in HL-60 (0.54 ± 0.07, P<0.05) and Jurkat (0.82±0.16, P<0.05). ④The methylation of ABO promoter in K562, HL-60 and Jurkat were 0, 58.14%, and 96.74%. As concentration of decitabine increased, the methylation of ABO promoter were decreased and the expressions of ABO mRNA were increased in HL-60 and Jurkat, which had significant differences compared with that before treatment (P<0.05).
Conclusion: The methylation of ABO promoter shows a negative correlation with ABO mRNA expression. DNA methylation was an important aspect of ABO antigens decrease in acute leukemia.

ABO血型系统是人类发现的第一个具有重大意义的血型系统，其表型是由正反定型两者决定的。但是，很多急性白血病患者出现ABO抗原减弱的现象，导致ABO血型正反定型不符，患者ABO血型无法定型。其机制可能与ABO基因启动子区CpG岛DNA甲基化导致的ABO基因沉默有关，ABO基因启动子甲基化程度越高，ABO基因的表达就越低，从而导致A、B抗原的表达量减少[1]–[2]。在本研究中我们对白血病患者和白血病细胞株进行ABO基因型、ABO mRNA及其启动子区CpG岛甲基化程度的检测，旨在探讨白血病ABO基因启动子区CpG岛甲基化对ABO基因表达的影响。

对象与方法

1．研究对象：以2015年1月至9月在我院诊治的25例初治白血病患者为研究对象，男11例，女14例，中位年龄22 (2~56）岁。参照《血液病诊断及疗效标准》[3]中相关标准进行诊断。25例患者中慢性髓性白血病（CML）5例，急性淋巴细胞白血病（ALL）10例（T-ALL 5例，B-ALL 5例），急性髓系白血病（AML）10例（M2 5例，M3 5例）。以20名正常人为健康对照，其中男8名，女12名，中位年龄24 (18~32）岁。白血病细胞株K562、HL-60和Jurkat细胞均由郑州大学干细胞中心提供。

2．ABO血型检查：采集患者及健康对照者肘静脉血3 ml，全自动血型仪（美国Bio-Rad公司产品）检测ABO血型。

3．细胞培养及分组：K562、HL-60和Jurkat细胞培养于含10％小牛血清、100 U/ml青/链霉素的RPMI 1640培养基中，37 °C、5%CO2、饱和湿度孵箱中培养，1~2 d换液1次，取对数生长期细胞进行后续实验。实验分为9组，分别为K562、HL-60和Jurkat细胞0、1、10 µmol/L地西他滨（西安杨森制药有限公司产品）作用组。调整细胞密度为1×106/ml，将不同浓度的地西他滨作用于细胞，使其终浓度分别为1、10 µmol/L，0 µmol/L地西他滨作用组为对照组，加入等体积培养基，48 h后收集细胞。

4．RNA和cDNA提取：总RNA提取试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。收集各组细胞并调整细胞密度为5×106/ml，按照说明书进行细胞总RNA的抽提和cDNA反转录，−20 °C保存备用。

5．采用序列特异性引物PCR (PCR-SSP）法检测ABO基因分型：采用人类ABO血型基因检测试剂盒（购自天津市秀鹏生物技术开发有限公司）检测对照组及10 µmol/L地西他滨作用组细胞的ABO基因型。试剂盒检测位点包括O1、O2、A1、A2和B，内参对照为人类生长激素基因（HGH）的保守片段。严格按试剂盒说明书进行操作，凝胶图像分析仪（英国Syngene公司产品）下观察并拍照分析结果。参照表1进行基因分型判断。

表1

人类ABO血型基因分型参照表

孔位	扩增产物（bp）	孔位阳性结果代表的基因型
1	196	O1
2	196	O2、B、A1、A2
3	220	O2
4	220	O1、B、A1、A2
5	246	B
6	246	A1、A2、O1、O2
7	155	A2
8	155	A1、B、O1、O2

6．实时荧光定量PCR (RQ-PCR）法检测ABO mRNA表达：总RNA提取试剂盒、AMV第一链cDNA合成试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司。收集各组细胞并调整细胞密度为5× 106/ml，按照说明书提取各组细胞总RNA，逆转录合成cDNA。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。ABO基因上游引物：5′-TTGTTTGGTT ACGGGGTCC-3′，下游引物：5′-GATGTCGAT GTTGAATGTGCC-3′，扩增片段长度222 bp，定位在ABO基因第7外显子；β-actin上游引物：5′-TAGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3′，下游引物：5′-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′，扩增片段为151 bp。PCR体系共20 µl，包括cDNA 2.0 µl，上下游引物各1.0 µl，SYBR Green PCR Master Mix 10 µl，余用无RNA酶水补足。PCR扩增条件：95 °C预变性3 min，95 °C 15 s, 60 °C 40 s，共40个循环。实验重复3次，利用各自的标准曲线分别对样品中的目的基因和内参基因进行定量，采用2−ΔΔCt法进行相对定量分析，以目的基因与β-actin的比值表示其相对表达水平。

7．亚硫酸氢盐测序法检测ABO基因启动子甲基化：从MethDB数据库中选取ABO基因启动子中富含CpG位点的区域，其基因片段中含有43个CpG位点，分别编号为1~43，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，上游引物序列：5′-TGAGAGATATTAGGAAAAGTAGGAAG-3′，下游引物序列：5′-CCRCAACCTATAACCCTCCAAC-3′，扩增片段为379 bp。

不同浓度的地西他滨作用48 h后，应用DNA提取试剂盒抽提各组细胞基因组DNA，应用紫外分光光度计测量吸光度（A）值，确定其纯度。将DNA产物经过亚硫酸氢钠修饰，使未甲基化的胞嘧啶（C）转化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的胞嘧啶不变。PCR扩增修饰后的基因组DNA，PCR体系50 µl，包括亚硫酸氢钠修饰后DNA模板3 µl，上下游引物各1 µl, dNTP 1 µl, 10×PCR缓冲液5 µl，Taq酶0.8 µl，余用双蒸水补足。PCR条件：98 °C预变性4 min，94 °C 45 s, 66 °C 45 s, 72 °C 1 min，20个循环；94 °C 45 s，56 °C 45 s，72 °C 1 min，共20个循环，72 °C延伸8 min。将PCR产物行30 g/L琼脂糖凝胶电泳，并将产物切胶后纯化回收，PCR纯化产物连接到pUC18-T载体，4 °C连接过夜。将连接产物转化感受态细胞，涂氨苄青霉素平板，37 °C孵育过夜，经蓝白斑筛选，挑取白色菌落至含氨苄青霉素的液体培养基，37 °C水平振摇12 h，提取其质粒，琼脂糖凝胶电泳PCR鉴定阳性重组子，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。DNA提取试剂盒、PCR产物纯化回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、感受态细胞制备试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

8．统计学处理：采用SPSS17.0软件进行统计学分析。每组设3个复孔，实验重复3次，数据以均数±标准差表示，差异性分析采用独立样本t检验，多样本差异性分析采用方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．白血病患者ABO基因启动子甲基化状态：健康对照组、CML、ALL和AML组ABO基因启动子平均甲基化率分别为2.33%、2.12%、53.85％和18.22%，ALL和AML组甲基化率高于健康对照组和CML组，后两组甲基化率接近，ALL组较AML组甲基化率高。B-ALL组与T-ALL组甲基化率接近，分别为54.07％和52.97%。AML-M2组与AML-M3组甲基化率接近，分别为21.32％和15.12%。25例白血病患者中全自动血型鉴定仪检测出抗原减弱者2例，均为AML-M2患者，甲基化率为49.61%，明显高于抗原未减弱者（11.89%）。

2．不同白血病细胞株细胞的ABO基因型：K562细胞的ABO基因型为O1O1，加入地西他滨（10 µmol/L）前后ABO基因型变化不大。HL-60和Jurkat细胞药物作用前条带亮度非常弱，基因型几乎无法辨认，加入地西他滨（10 µmol/L）后条带亮度增加，ABO基因型显示为O1A1和A1O2（图1）。

图1

序列特异性引物PCR法检测地西他滨（10 µmol/L）作用后对白血病细胞株ABO基因型的影响

1~8：分别为人类ABO血型基因检测试剂点样孔位。1：O1孔位；2：O2、B、A1、A2孔位；3：O2孔位；4：O1、B、A1、A2孔位；5：B 孔位；6：A1、A2、O1、O2孔位；7：A2孔位；8：A1、B、O1、O2孔位

3．不同白血病细胞株细胞的ABO mRNA表达：地西他滨作用前，K562细胞ABO mRNA相对表达水平为1 275.67±35.86，明显高于HL-60细胞的0.54±0.07和Jurkat细胞的0.82±0.16（P值均<0.01），而HL-60和Junkat细胞组差异则无统计学意义（P> 0.05）；1、10 µmol/L地西他滨作用后，HL-60和Jurkat细胞组ABO mRNA的表达水平明显高于对照组（0 µmol/L地西他滨作用组）（P值均<0.05），K562细胞与对照组差异无统计学意义（P值均> 0.05）（表2）。进一步行1、10 µmol/L地西他滨作用组间比较，K562、HL-60细胞两浓度组ABO mRNA的表达水平差异均无统计学意义（P值均>0.05），Jurkat细胞两浓度组差异有统计学意义（P<0.05）（表2、图2）。

表2

实时荧光定量PCR法检测不同浓度地西他滨作用48 h后对白血病细胞ABO mRNA表达水平的影响（±s）

组别	地西他滨作用浓度
	0 µmol/L	1 µmol/L	10 µmol/L
K562细胞组	1 275.67±35.86	1 320.36±13.95	1 369.90±109.70
HL-60细胞组	0.54±0.07a	2.93±0.81ab	4.42±0.82ab
Jurkat细胞组	0.82±0.16a	4.10±0.34ab	15.51±0.96abc

注：a：与K562细胞组比较，P<0.01；b：与0 µmol/L地西他滨作用组（对照组）比较，P<0.05；c：与1 µmol/L地西他滨作用组比较，P<0.05。每组设3个复孔，实验重复3次

图2

实时荧光定量PCR法检测不同浓度地西他滨作用48 h后对白血病细胞ABO mRNA表达的影响

M：Marker；1~3：分别为K562细胞0、1、10 µmol/L地西他滨作用组；4~6：分别为HL-60细胞0、1、10 µmol/L地西他滨作用组；7~9：分别为Jurkat细胞0、1、10 µmol/L地西他滨作用组

4．不同白血病细胞株细胞ABO基因启动子CpG岛甲基化状态：结果显示ABO基因启动子43个CpG岛中，K562细胞在加入地西他滨前后均未发生甲基化；Jurkat细胞未加药组则呈现超甲基化状态，甲基化率达96.74%，1、10 µmol/L地西他滨作用组甲基化率分别为84.18％和68.37%，明显低于未加药组（P<0.05），地西他滨两个浓度组比较差异也有统计学意义（P<0.05）；HL-60细胞未加药组甲基化率为58.14%，1、10 µmol/L地西他滨作用组甲基化率分别为35.35％和22.33%，明显低于未加药组（P<0.05），但地西他滨两个浓度组比较差异无统计学意义（P>0.05）（图3）。

图3

亚硫酸氢盐测序法检测不同浓度地西他滨作用48 h后白血病细胞ABO基因启动子CpG岛甲基化状态

A：K562细胞；B：HL-60细胞；C：Jurkat细胞；1、2、3分别为0、1、10µmol/L地西他滨作用组

讨论

ABO血型系统是1900年由Karl Landsteiner发现的[4]，是人类发现的第一个具有重大意义的血型系统。人ABO血型由体内ABO抗原和抗体共同决定，正定型检测红细胞抗原，反定型检测血清中抗体，二者相符才能正确、完整地进行ABO血型的定型检测。但在白血病及一些实体瘤患者进行ABO血型鉴定时，出现ABO抗原改变导致正反定型不相符合的情况，极易引起血型误判，直接关系到临床输血安全。血液系统恶性肿瘤中ABO抗原改变最早由van Loghem等[5]于1957年报道。随后又有学者陆续报道了在恶性血液病及许多实体瘤如口腔上皮癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌中出现ABO抗原减弱的现象[6]–[10]。并分析可能的机制有ABO基因杂合性丢失、基因突变和DNA甲基化导致基因沉默[2],[9]。目前研究发现，白血病患者ABO抗原减弱与DNA甲基化导致ABO基因沉默关系更为密切[2],[11]。DNA甲基化通常发生在富含胞嘧啶和鸟嘌呤的CpG二核苷酸（CpG岛）中的胞嘧啶残基上，生理情况下CpG岛多为非甲基化，而在癌变过程中CpG岛的甲基化则扮演着重要角色，甲基化程度的高低可能与肿瘤的发生、发展密切相关[12]–[13]。ABO基因启动子区富含CpG核苷酸[14]，研究显示在人类癌细胞系和癌症患者中DNA甲基化与ABO基因表达呈负相关[2],[8]–[9]。

在本研究中我们对比了25例白血病患者与20名健康对照者ABO基因启动子的甲基化程度，发现CML组ABO基因启动子平均甲基化率与健康对照组接近，初治ALL组和AML组均明显高于健康对照组，ALL组甲基化率明显高于AML组。在25例急性白血病患者中全自动血型鉴定仪检测出抗原减弱者2例，均为AML-M2患者，且抗原减弱者甲基化率明显高于抗原未减弱者，提示AML-M2患者ABO抗原水平与甲基化程度呈负相关。徐华等[15]研究发现各型血液病患者中AML患者A/B抗原数量下降程度最大，我们的研究结果与之相符。在本研究中我们未发现ALL与AML-M3患者有抗原减弱现象，但其甲基化程度也明显高于健康对照者，而CML患者几乎没有甲基化的表现。

在体外实验中，我们检测了3种白血病细胞株细胞的ABO基因型、ABO mRNA表达水平以及ABO基因启动子甲基化状态。结果显示，K562细胞基因型为O1O1，ABO基因启动子均未发生甲基化，且ABO mRNA表达水平最高；而Jurkat、HL-60细胞则有不同程度的甲基化，基因型检测条带亮度非常弱，ABO mRNA表达水平极低，此结果与相应的白血病患者原代细胞检测结果相符，加入去甲基化药物地西他滨后，两细胞株细胞的基因型检测条带亮度增强，甲基化水平随地西他滨浓度增高而下降，ABO mRNA表达水平随地西他滨浓度增高而增高。Hosoi等[16]对27种白血病细胞株细胞进行检测，显示CML细胞株K562细胞和KOPM-28细胞均高表达ABO mRNA，明显高于其他髓系和淋巴细胞白血病细胞株；Bianco-Miotto等[2]对6种白血病细胞株细胞进行甲基化和ABO基因型的检测，结果显示，除K562细胞为非甲基化外，其余5种细胞株均有甲基化，Jurkat细胞应用去甲基化药物后方可检测出ABO基因型为O1O2。我们在研究中加入去甲基化药物地西他滨后，检测到Jurkat细胞ABO基因型为A1O2，与Kominato等[11]的研究结果相符。HL-60细胞在各文献中未见相关ABO基因型的报道。

综上，白血病ABO抗原表达水平与ABO基因启动子区CpG岛甲基化程度密切相关，但是DNA的甲基化作为影响细胞内基因转录最重要的表观遗传学机制，是不断动态变化的，并对环境的影响非常敏感，因此不同患者和细胞的甲基化状态有很大的异质性。而且在临床中我们发现白血病患者ABO抗原减弱的现象出现最多的是AML[15]。在本研究中，我们发现ALL患者原代细胞以及Jurkat细胞ABO基因启动子甲基化的程度最大，但是ALL患者出现ABO抗原减弱的数量并没有AML患者多；AML患者ABO基因启动子甲基化的程度并不是特别高，不过AML抗原减弱的患者ABO基因启动子甲基化的程度明显增高。形成此现象的原因以及白血病患者ABO基因CpG岛甲基化程度与预后的关系，有待我们扩大样本量并追踪其预后，进行更加深入的研究。