[The role of Tim-3 mRNA in acute graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation].

OBJECTIVE: To investigate the role of Tim-3 gene expression in acute graft-versus-host disease (aGVHD) after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT).
METHODS: Patients after allo-HSCT were retrospectively analyzed, this cohort of patients were divided into different groups according to disease states (grade 0-Ⅰ aGVHD group, grade Ⅱ-Ⅳ aGVHD group, improved aGVHD group) and time periods (+14-+30 d, +31-+60 d, +61-+100 d) to compare PBMC Tim-3 mRNA expression and plasma IFN-γ, IL-2 concentrations among them.
RESULTS: RT-PCR showed that in grade 0-Ⅰ aGVHD group, Tim-3 mRNA expression in patients +31-+60 d (7.24±2.79) was significantly higher than that in patients + 14-+ 30 d (4.60±1.66) and + 61-+ 100 d (3.86±1.36) (P<0.05). Tim-3 mRNA expressions of grade Ⅱ-Ⅳ aGVHD group in patients +14-+30 d, +31-+60 d, +61-+100 d were 9.54± 3.05, 10.14±3.28, 12.82±4.20, respectively, which in both +14-+30 d and +61-+100 d were significantly higher than that of grade 0-Ⅰ aGVHD and improved aGVHD groups (P<0.05). In patients +31-+60 d, Tim-3 expression of grade Ⅱ-Ⅳ aGVHD group was higher than improved aGVHD group (2.49±0.89), while no statistical difference when compared with grade 0-Ⅰ aGVHD group (7.24±2.79). In grade Ⅱ-Ⅳ aGVHD group, Tim-3 mRNA expression manifested no statistical difference among grades or organ involved (P>0.05). ELISA results showed that plasma IFN-γ and IL-2 concentrations were higher in grade Ⅱ-Ⅳ aGVHD group than of other groups, while no significant difference existed between grade 0-Ⅰ aGVHD and improved aGVHD groups (P<0.05).
CONCLUSION: Tim-3 played an important role in the process of aGVHD.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）是治疗恶性血液病、某些遗传性疾病、自身免疫性疾病的有效方法，而急性移植物抗宿主病（aGVHD）是移植早期的重要并发症和主要死亡原因[1]。相关研究表明，T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域分子3 (T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3, Tim-3）与器官移植后急性排斥（acute rejection, AcR）有密切的关系。因此，本研究我们通过检测血液病患者allo-HSCT后外周血单个核细胞（PBMC）Tim-3 mRNA水平来研究其在aGVHD中的作用，现报道如下。

对象与方法

1．病例资料：以2014年8月至2015年2月苏州大学附属第一医院血液科行allo-HSCT的100例血液病患者为研究对象。入组标准：①获得造血重建；②原发血液病处于缓解状态或骨髓检查基本正常；③若发生aGVHD，仅累及单一脏器。排除标准：①CMV血症；②EBV血症；③结缔组织病。其中男67例，女33例，中位年龄为36(18~55）岁。原发病：急性淋巴细胞白血病24例，急性髓系白血病36例，急性混合细胞白血病9例，慢性髓性白血病6例，淋巴瘤4例，骨髓增生异常综合征11例，重型再生障碍性贫血7例，阵发性睡眠性血红蛋白尿症3例。

2．移植情况：供者来源：100例患者中，HLA相合同胞供者43例（43.0%），HLA相合无关供者35例（35.0%），亲缘单倍型供者22例（22.0%）。其中32例（32.0%）为女供男。预处理方案：HLA相合同胞供者HSCT主要采用改良BU/CY（白消安＋环磷酰胺）方案，HLA相合无关供者和单倍型供者HSCT主要采用BU/Flu（白消安＋氟达拉滨）方案，对淋巴细胞白血病或合并中枢神经系统白血病（CNSL）的患者加用全身照射。造血干细胞来源：骨髓＋外周血50例（50.0%）、骨髓7例（7.0%）、外周血43例（43.0%）。

3．GVHD预防和诊治：HLA相合同胞供者HSCT采用经典的环孢素A(CsA）＋短程甲氨蝶呤（MTX）方案预防GVHD, HLA相合无关供者或单倍型HSCT采用CsA＋短程MTX＋霉酚酸酯（MMF）+抗人胸腺细胞球蛋白（ATG）预防GVHD，具体用法：MTX 15 mg·m–2·d–1，+1 d，10 mg·m–2·d–1，+3、+7、+11 d; CsA 3 mg·kg–1·d–1，自–10 d开始应用；MMF 30 mg·kg–1·d–1，自-7 d开始应用；ATG（美国Genzyme公司产品）2.5 mg·kg–1·d–1，–5~–2 d. aGVHD的诊断采用国际标准[2]。发生GVHD时立即给予甲泼尼龙1~2 mg·kg–1·d–1治疗，治疗无效的患者给予二线药物他克莫司、抗CD25单抗、吗替麦考酚酯、TNF-α单抗等治疗。

4．主要试剂及仪器：TBD人外周血淋巴细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限公司；TRIzol、M-MLV逆转录试剂盒、dNTP及随机引物购自美国Invitrogen公司；EvaGreen染料购自美国Biotium公司；人IFN-γ、人IL-2 ELISA检测试剂盒购自上海西塘生物科技有限公司。普通PCR仪、ABI 7500荧光定量PCR仪均购自美国Applied Biosystems公司。

5．标本收集及处理：留取患者Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗前或治疗好转后外周血标本4 ml，其中aGVHD治疗前标本38份，治疗好转后标本30份；留取和Ⅱ~Ⅳ度aGVHD标本时间类似的0（未发生）~Ⅰ度aGVHD外周血标本32份。EDTA抗凝，常温离心，留取上清进行ELISA检测，采用TBD淋巴细胞分离液分离PBMC进行RT-PCR检测。

6．RT-PCR检测Tim-3 mRNA表达：按TRIzol试剂盒说明提取PBMC总RNA，采用M-MLV逆转录试剂盒逆转录合成cDNA。以cDNA为模板进行RT-PCR。引物序列：Tim-3上游引物：5′-CTGCTGCTACTACTTACAAGGTC-3′，下游引物：5′-GCAGGGCAGATAGGCATTCT-3′，产物长度75 bp；β-actin上游引物：5′-ACTGGGACGACATGGAGAAA-3′，下游引物：5′-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3′，产物长度188 bp。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。反应体系：10×缓冲液2 µl，Mg2+ 1.5 µl，dNTP 0.4 µl，上、下游引物各0.5 µl，Tag酶0.1 µl，模板cDNA 1.5 µl, EvaGreen染料0.5 µl，去离子水补至20 µl。PCR条件（两步法）：50 °C 2 min, 95 °C 10 min; 95 °C 15 s, 60 °C 60 s（期间进行荧光采集），共40个循环。采用2–ΔΔCt相对定量方法计算Tim-3 mRNA的表达水平。设3个复管，实验重复3次。

7．ELISA法检测血浆IFN-γ、IL-2水平：因ELISA对实验条件的均一性要求很高（所有标本应尽可能在同一块板上进行加样、孵育、检测），我们在各组中随机挑取标本进行检测。严格按照试剂盒说明进行操作，设2个复孔，用酶标仪检测450 nm处吸光度（A）值。实验重复3次。

8．统计学处理：应用GraphPad Prism 5.0软件进行数据分析，数据均符合正态分布，用均数±标准差表示，组间比较采用t检验或t′检验。所有的统计数据均为双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．aGVHD发生情况：全部100例行allo-HSCT患者中，68例（68.0%）发生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD，Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ度分别为41、20和7例；32例（32.0%）发生0~Ⅰ度aGVHD（0、Ⅰ度分别为27、5例）。发生aGVHD的中位时间为＋32（+11~＋80) d。其中68例Ⅱ~Ⅳ度aGVHD患者中38例aGVHD未治疗时取外周血标本进行分析，为Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗前组；30例aGVHD治疗好转后取外周血标本进行分析，为Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗好转组。比较各组＋14~＋30 d、+31~+60 d、+61~+100 d Tim-3 mRNA及血浆IFN-γ、IL-2水平。

2．Tim-3 mRNA表达水平：0~Ⅰ度aGVHD患者＋14~＋30 d、+31~＋60 d、+61~+100 d PBMC Tim-3 mRNA相对表达量分别为4.60±1.66、7.24±2.79和3.86±1.36（表1），+31~+60 d Tim-3 mRNA表达明显高于＋14~＋30 d、+61~＋100 d这两个阶段（P值均<0.05），+14~＋30 d与＋61~＋100 d的Tim-3 mRNA水平比较差异无统计学意义（P=0.502）。+14~＋30 d、+ 61~+ 100 d Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗前组的Tim-3 mRNA表达均明显高于0~Ⅰ度aGVHD组及治疗好转组。+31~＋60 d，Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗前组的Tim-3 mRNA水平明显高于治疗好转组，与0~Ⅰ度aGVHD组相比差异无统计学意义（表1）。

表1

移植后三个不同阶段各急性移植物抗宿主病（aGVHD）组外周血单个核细胞Tim-3 mRNA表达水平（±s）

组别	+14~+30 d		+31~+60 d		+61~+100 d
	例数	结果	例数	结果	例数	结果
0~Ⅰ度aGVHD组	20	4.60±1.66	6	7.24±2.79	6	3.86±1.36
Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组
治疗前	11	9.54±3.05a	12	10.14±3.28	15	12.82±4.20a
治疗好转	8	3.90±1.31b	12	2.49±0.89ab	10	3.70±1.52b

注：与0~Ⅰ度aGVHD组比较，aP<0.01；与治疗前组比较，bP<0.01

Ⅱ~Ⅳ度aGVHD患者＋14~＋30 d、+31~＋60 d、+61~+100 d PBMC Tim-3 mRNA相对表达水平两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）。将此三个阶段数据汇总，Ⅱ度（22例）、Ⅲ度（10例）、Ⅳ度（6例）aGVHD组Tim-3 mRNA相对定量分别为11.47± 3.95、10.00±3.82、11.09±3.67，两两比较差异无统计学意义（P>0.05）（图1A）。皮肤aGVHD组（26例）和肠道aGVHD组（12例）Tim-3 mRNA相对定量分别为11.15±3.57、10.73±4.49，差异无统计学意义（P= 0.757）（图1B）。

图1

不同程度（A）及不同器官（B）急性移植物抗宿主病（aGVHD）患者外周血单个核细胞Tim-3 mRNA表达水平比较

3．ELISA法检测血浆IFN-γ、IL-2水平：血浆IFN-γ、IL-2水平见表2，结果显示，Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗前组血浆IFN-γ、IL-2水平明显高于其他各组（P<0.05），而治疗好转组血浆IFN-γ、IL-2水平与0~Ⅰ度aGVHD组比较差异无统计学意义（P>0.05）。

表2

急性移植物抗宿主病（aGVHD）患者不同时间段血浆IFN-γ、IL-2水平比较（ng/L，±s）

组别	+14~+30 d			+31~+60 d			+61~+100 d
	例数	IFN-γ	IL-2	例数	IFN-γ	IL-2	例数	IFN-γ	IL-2
0~Ⅰ度aGVHD组	8	18.17±13.01	2.716±0.380	6	22.90±14.84	2.596±0.171	6	18.13±13.27	2.646±0.240
Ⅱ~Ⅳ度aGVHD组
治疗前	7	68.98±30.39a	3.585±0.781a	6	77.62±32.13a	3.245±0.215a	7	80.43±32.88a	3.213±0.303a
治疗好转	7	11.24±8.33b	2.494±0.101b	7	13.60±8.13b	2.561±0.162b	7	14.00±12.41b	2.716±0.151b

注：与0~Ⅰ度aGVHD组比较，aP<0.05；与治疗前组比较，bP<0.05。设2个复孔，实验重复3次

讨论

Tim-3是2001年McIntire等[3]在研究过敏和哮喘基因的过程中发现并定位克隆的一个新的基因，表达于Th1细胞、Th17细胞、CD8细胞、调节性T细胞、NK细胞、单核细胞、DC等免疫细胞上[4]–[7]，并在某些肿瘤如乳腺癌、肺癌、宫颈癌中也发现了Tim-3的表达[8]。Tim-3与其配体半乳糖凝集素-9（Galectin-9）特异性结合，可诱导Tim-3+效应性T细胞（包括Th1细胞、Th17细胞、CD8+ T细胞等）的特异性清除。其免疫调节作用在自身免疫性疾病、变态反应性疾病、肿瘤免疫以及病毒免疫等方面均得到证实[9]。

关于Tim-3在AcR中的作用，Renesto等[10]发现肾移植后AcR患者尿液中Tim-3 mRNA水平明显高于无AcR者，且Tim-3 mRNA水平改变和尿液中IFN-γ mRNA水平变化呈正相关（r2=0.76，P< 0.001）。治疗效果不明显的AcR患者，Tim-3 mRNA水平减低，提示了负性共刺激分子缺乏和预后差之间的关系。Luo等[11]以肾移植患者的外周血为标本做了类似的实验，得出与上述实验相同的结果。以上研究认为Tim-3可作为一种无创的监测肾移植后AcR的生物标志物。在国内，方泽民等[12]也发现Tim-3在小鼠异基因心脏移植受者引流淋巴结和移植心内T淋巴细胞上的表达升高与AcR的进展动态相关。

本研究我们针对Tim-3与aGVHD的关系进行了初步探索，发现allo-HSCT后0~Ⅰ度aGVHD患者+ 31~+ 60 d Tim-3 mRNA水平明显升高，结合Tim-3在外周血细胞中的表达谱及2012年Ndhlovu等[13]提出的Tim-3是NK细胞成熟的标志，同时allo-HSCT后免疫重建的一般规律中，NK细胞在移植后1个月重建达到高峰，我们考虑＋31~＋60 d Tim-3 mRNA水平高于＋14~＋30 d和＋61~＋100 d和NK细胞重建相关。

当患者发生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD时，在治疗前抽取外周血进行检测，+14~＋30 d和＋61~+100 d这两个阶段Tim-3 mRNA相对定量明显升高，此结果和Renesto等[10]的研究结果相一致。而＋31~+ 60 d Ⅱ~Ⅳ度aGVHD治疗前患者和0~Ⅰ度aGVHD患者外周血Tim-3 mRNA水平相比差异无统计学意义，可能和该阶段免疫耐受患者Tim-3 mRNA表达水平基础值较其他时间段明显升高相关。

之后进一步研究aGVHD不同程度以及不同器官的PBMC Tim-3 mRNA水平变化，结果显示，不同严重程度的aGVHD患者其Tim-3 mRNA相对定量比较差异无统计学意义，同时，皮肤和肠道aGVHD患者的Tim-3 mRNA水平差异也无统计学意义，提示Tim-3在aGVHD的发展过程中是一个相当敏感的指标，和aGVHD的程度及累及脏器无明显相关性。

在检测Tim-3水平的同时，Ponciano等[14]同时检测20例因AcR而手术摘除的移植肾中Tim-3、颗粒酶B、穿孔素、IFN-γ及FASL的表达，发现AcR组上述所有分子的mRNA表达均上调。aGVHD治疗前组血浆IFN-γ、IL-2水平均明显升高，而aGVHD治疗好转组明显低于0~Ⅰ度aGVHD组，与PBMC Tim-3 mRNA水平存在着同样的变化趋势。由于IFN-γ、IL-2和aGVHD的发生和发展密切相关，提示Tim-3在aGVHD的发生和发展过程中发挥着重要作用。

综上所述，allo-HSCT后患者体内Tim-3、IL-2、IFN-γ水平与aGVHD的发生有密切的关系。监测Tim-3水平对aGVHD早期诊断、判断预后及指导免疫抑制剂的应用具有重要的意义，可作为早期判断和监测aGVHD的指标。本研究仅针对PBMC进行Tim-3 mRNA水平的研究，且RT-PCR实验结果本身存在不稳定性。有学者指出Tim-3/Galectin-9信号通路对aGVHD的影响依赖调节性T细胞的作用[15]，提示aGVHD过程中Tim-3对各免疫细胞亚群的作用不同，从而引起细胞间的相互影响，其具体作用仍需进一步研究。由于选择性剪切和拼接，Tim-3可形成胞膜型及游离型两种，已有研究初步证实游离型Tim-3和肠道重症GVHD相关[16]，而关于aGVHD中以上两种类型Tim-3的变化及相互关系，也需要进一步探讨。