[Clinical observation of chromosomal abnormalities in Ph negative cells of chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors].

OBJECTIVE: To observe the clinical features, characteristics and outcomes of chromosomal abnormalities in Philadelphia negative cells (Ph(-)CA) of chronic myeloid leukemia (CML) patients treated with tyrosine kinase inhibitor (TKI), and provide the evidence for clinical treatment.
METHODS: We collected and analyzed the clinical and laboratory data of 8 CML patients treated in the affiliated Tumor Hospital of Zhengzhou University from September 2011 to July 2015 and Ph(-)CA occurred after TKI therapy. Karyotypes and BCR-ABL fusion genes were analyzed by R-banding and real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR), respectively.
RESULTS: 6 cases were male and 2 cases were female, with a median age of 51 (31-75) years old. 6 patients had low Sokal risk scores and 2 had intermediate scores. 4 cases of Ph(-) CA occurred with imatinib, 1 case with dasatinib and 3 cases with nilotinib. The median duration of Ph(-) CA appearance was 12.0 (1.7-34.5) months since taking TKI. Chromosomal abnormality +8 was the most common type in Ph(-)CA, which accounted for 50.0%, followed by -7 (25.0%). When found Ph(-)CA, all patients had complete hematologic response (CHR), but none got main molecular response (MMR). The Ph(-)CA had gone in 7 cases at the end of follow-up and the median duration was 6.2 (2.5-31.5) months. After Ph(-) CA disappeared, 1 patient obtained MMR and 2 cases achieved complete molecular response (CMR), but Ph(+) clone recurred in 1 case.
CONCLUSION: Ph(-)CA can be found in CML patients treated with imatinib, dasatinib and nilotinib, and +8 is the most common Ph(-)CA. So detection of karyotype is significant during treatment. Although most Ph(-)CA can disappear, -7/7q- or other complex karyotypes should be monitored closely.

慢性髓性白血病（CML）是造血干细胞克隆性增殖形成的恶性肿瘤，其标志性特征为Ph染色体，可形成BCR-ABL融合基因[1]。该基因编码产生的BCR-ABL融合蛋白具有高酪氨酸激酶活性。因此，酪氨酸激酶抑制剂（TKI）如伊马替尼（IM），能特异性抑制BCR-ABL的表达，阻断细胞信号转导，抑制BCR-ABL阳性细胞的增殖，并诱导细胞生长停滞和凋亡[2]–[3]。但部分患者对IM不耐受或出现IM原发、继发耐药。随着二、三代TKI的应用，更多的CML患者可获得长期生存。国外文献报道部分CML患者在接受IM、达沙替尼、尼洛替尼治疗过程中可出现Ph−细胞染色体异常（chromosomal abnormalities in Philadelphia negative cells，Ph−CA）[4]–[7]。国内对TKI治疗后出现Ph−CA的系统报道较少，现收集我院TKI治疗后出现Ph−CA的8例CML患者的临床资料进行分析，探讨其临床特征、染色体特点和转归，为临床治疗提供依据。

病例与方法

1．病例来源：2011年9月至2015年7月在我院接受IM、达沙替尼或尼洛替尼治疗后出现Ph−CA的8例CML患者纳入研究。所有患者均行血常规、细胞形态学、细胞遗传学、BCR-ABL融合基因等实验室检查，诊断和分期符合文献[8]标准。TKI用法：IM 400 mg/d，达沙替尼100 mg/d，尼洛替尼600 mg/d，出现Ph−CA后仍以原剂量进行治疗。

2．染色体制备及分析：抽取患者骨髓液5~8 ml，肝素抗凝，将细胞按（1~3）×106/ml密度接种于含20％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37 °C恒温培养箱内行短期培养，按常规制备染色体标本，进行R显带分析，计数分析10~20个分裂中期细胞，核型异常识别和描述按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2009）》[9]。

3．实时定量PCR (RQ-PCR）监测BCR-ABL融合基因：抽取患者骨髓液2 ml，提取总RNA，采用RQ-PCR方法检测BCR-ABL融合基因水平。以ABL为内参基因，BCR-ABL融合基因水平（％）=BCR-ABL拷贝数/ABL拷贝数×100%。我院BCR-ABL国际标准转化系数为0.81，即BCR-ABLIS=BCR-ABL×0.81。

4．随访：通过门诊、电话等方式进行随访，随访截止时间为2015年7月31日，随访内容包括骨髓细胞形态学、细胞遗传学、分子生物学结果等。

结果

1．临床资料：经TKI治疗后出现Ph−CA的8例CML患者中，男6例、女2例，中位年龄51 (31~75）岁；8例患者确诊时均为慢性期，6例为Sokal评分低危，2例为中危。确诊至开始TKI治疗的中位时间为5.3 (0.5~137.9）个月，期间3例患者接受干扰素治疗，另5例接受羟基脲治疗。开始TKI治疗时例1已进入急变期，余7例仍为慢性期。3种TKI治疗后CML患者均可出现Ph−CA，其中IM 4例、达沙替尼1例、尼洛替尼3例，出现Ph−CA时TKI应用的中位时间为12.0 (1.7~34.5）个月（表1）。

表1

8例TKI治疗后出现Ph−CA慢性髓性白血病患者的临床资料

例号	性别	年龄（岁）	确诊时分期	Sokal评分	TKI治疗前核型	TKI前治疗	TKI治疗前病程（月）	TKI治疗时分期	出现Ph−CA时TKI种类	已应用TKI时间（月）
1	男	63	CP	0.74	46,XY,t（9;22）（q34;q11）[4]/46,XY[16]	干扰素	137.9	BC	达沙替尼	1.7
2	女	37	CP	0.66	46,XX,t（9;22）（q34;q11）[12]/46,XX[6]	干扰素	25.1	CP	尼洛替尼	23.3
3	男	45	CP	0.63	46,XY,t（9;14）（q21;q22）, t（9;22）（q34;q11）[20]	羟基脲	0.5	CP	伊马替尼	20.1
4	男	31	CP	0.75	46,XY,t（9;22）（q34;q11）[20]	羟基脲	0.7	CP	尼洛替尼	13.9
5	男	46	CP	0.72	46,XY,t（9;22）（q34;q11）[12]/46,XY[8]	干扰素	9.2	CP	伊马替尼	6.8
6	男	51	CP	0.81	46,XY,t（9;22）（q34;q11）[20]	羟基脲	1.2	CP	伊马替尼	34.5
7	女	51	CP	0.74	46,XY,t（9;22）（q34;q11）[20]	羟基脲	1.4	CP	尼洛替尼	3.1
8	男	75	CP	0.94	46,XY,t（9;22）（q34;q11）[20]	羟基脲	10.1	CP	伊马替尼	10.1

注：TKI：酪氨酸激酶抑制剂；Ph−CA：Ph阴性细胞染色体异常；CP：慢性期；BC：急变期

2．出现Ph−CA患者染色体特点：8例患者确诊时均为Ph染色体阳性，在染色体核型动态监测中4例出现+8, 2例出现−7，其他异常2例（表2）。其中例3在确诊时伴有t(9;14）（q21;q22），IM治疗第20个月时Ph染色体、t（9;14）（q21;q22）消失，+Y出现，之后复查均为正常核型。

表2

8例TKI治疗后出现Ph−CA慢性髓性白血病患者的转归

例号	出现Ph−CA时染色体核型	血液学反应	分子生物学反应	随访时间（月）	TKI治疗总时间（月）	Ph−CA持续时间（月）	Ph−CA消失后细胞遗传学反应	Ph−CA消失后分子生物学反应
1	46,XY,del（20）（q11）[10]	CHR	未达MMR	3.7	5.4	>3.7	–	–
2	47,XX,+8[6]/46,XX[11]	CHR	未达MMR	45.4	68.7	31.5	未获得CCyR	未获得MMR
3	47,XY,+Y[2]/46,XY[4]	CHR	未达MMR	23.4	43.5	5.1	CCyR	未获得MMR
4	45,XY,−7[10]	CHR	未达MMR	6.2	20.1	6.2	丧失CCyR	未获得MMR
5	47,XY,+8[2]/46,XY[4]	CHR	未达MMR	21.2	28.0	2.9	CCyR	CMR
6	47,XY,+8[4]	CHR	未达MMR	22.1	56.6	2.5	CCyR	MMR
7	45,XX,−7[9]/47,idem,+6,+8[1]	CHR	未达MMR	36.9	40.0	29.3	CCyR	CMR
8	46,XY,−2,−3,+mar1,+mar2[2]	CHR	未达MMR	6.8	16.9	6.8	CCyR	未获得MMR

注：TKI：酪氨酸激酶抑制剂；Ph−CA：Ph阴性细胞染色体异常；随访时间指自Ph−CA出现至随访截止时间；CHR：完全血液学反应；MMR：主要分子学反应；CCyR：完全细胞遗传学反应；CMR：完全分子学反应；–：未评估

3. Ph−CA患者的转归：Ph−CA出现时8例患者均获得完全血液学反应（CHR），但未获得主要分子学反应（MMR）。至随访截止时例1 Ph−CA仍持续存在，余7例已消失，持续时间为6.2 (2.5~31.5）个月，接受TKI治疗的总时间为34.0（5.4~68.7）个月。在Ph−CA已消失的7例患者中，1例获得MMR，2例获得完全分子学反应（CMR），2例仅获得完全细胞遗传学反应（CCyR），1例再次出现Ph+克隆并丧失CCyR, 1例（例2）至随访结束时仍未获得CCyR（表2）。

讨论

虽然目前外周血RQ-PCR法监测CML能更加敏感地反映深层次的肿瘤负荷[10]，但仅根据RQ-PCR监测无法识别Ph+或Ph−克隆演变，从而无法发现遗传学不稳定或疾病进展的特征，因此，骨髓染色体核型分析在反映白血病负荷、评估疗效、判断预后等方面的作用是无可取代的[11]。染色体异常核型+8、+Ph、i(17q）等被公认是独立的预示CML疾病进展的指标[12]，但对获得遗传学反应期间出现的Ph−CA的意义，尚无明确结论。自Andersen等[13]首次报道CML患者接受IM治疗后出现Ph−CA以来，陆续有文献报道IM治疗后Ph−CA的发生，发生率为1.6%~20.6%[14]，以+8、−Y、−7/7q−、20q−最常见[4]。国内报道以＋8多见，未见−7/7q−[15]–[16]。本研究结果显示，8例出现Ph−CA的患者中，+8最常见，占50.0%，其次为−7 (25.0%）、del (20）（q11）（12.5%）、+Y (12.5%）等，与文献[14]报道一致。Zeidan等[6]和Baldazzi等[7]曾报道4例CML患者在尼洛替尼二线治疗过程中出现Ph−CA，主要为＋8和−7，本研究中3例患者在尼洛替尼治疗过程亦出现＋8、−7、+6。而Wang等[17]的研究证实尼洛替尼一线治疗CML患者也可发生Ph−CA，主要为＋8、−20、−21。本研究中出现Ph−CA时TKI应用的中位时间为12.0（1.7~34.5）个月，短于Jabbour等[4]报道的18个月。这可能与TKI种类及样本量较少有关，本研究中应用IM出现Ph−CA 4例、达沙替尼1例、尼洛替尼3例，二代TKI获得遗传学反应时间较一代短，故Ph−CA出现的中位时间会缩短。至随访截止时7例（87.5%）患者Ph−CA已消失，持续时间为6.2 (2.5~31.5）个月，与Jabbour等[4]报道的50％以上患者会出现Ph−CA且中位持续时间为5个月的结果一致。

TKI治疗后Ph−CA的发生原因及机制尚不明确，可能与以下因素有关：①Ph+克隆被抑制后亚克隆获得优势生长[18]。患者在TKI治疗前，骨髓以Ph+克隆为主，Ph−亚克隆被抑制，应用TKI后Ph+克隆被抑制，Ph−亚克隆获得优势生长，原有的核型异常表现出来。因而，Ph−CA常出现在获遗传学反应后。②与TKI的应用有关。TKI可抑制ABL的转录表达，而正常ABL与DNA损伤后P53介导的增殖抑制和凋亡有关，可以推测TKI对正常ABL激酶的抑制能导致基因组的不稳定，使正常细胞出现遗传学异常[19]；另外TKI可抑制Kit酪氨酸激酶，从而增加Ph+克隆受抑时残存Ph−干细胞重建造血的增殖压力，导致新克隆的出现[14]。③与CML疾病的发生相关。CML的发生是一个多基因多步骤的过程，“第一次打击”后表现为核型正常但遗传学不稳定，易被外界刺激损伤，经“第二次打击”后可出现除Ph+外其他染色体异常。Jabbour等[4]和Medina等[20]发现未使用任何药物的CML患者也会出现Ph−CA，提示Ph−CA可能反映了CML患者造血干细胞本质的、而非治疗相关的异常。

CML发病的遗传学特征为t (9;22）（q34;q11）异常，产生BCR-ABL融合基因，进而持续激活BCR-ABL酪氨酸激酶，而TKI通过占据BCR-ABL融合蛋白的ATP结合位点抑制BCR-ABL蛋白的自身磷酸化和底物磷酸化，达到切断BCR-ABL激活下游效应分子的作用，从而使BCR-ABL阳性细胞的增殖受抑制或者发生凋亡，因此TKI治疗后多数患者可获得CCyR及MMR，甚至CMR。而此时患者体内仍可能存在Ph+细胞，持续产生BCR-ABL融合基因，但受到目前的检测方法的限制，未能更深一步进行检测。有学者认为此类细胞中应存在CML干细胞，这种细胞并不依赖于BCR-ABL融合蛋白活性而存活，因此，针对BCR-ABL融合蛋白的TKI无法杀死CML干细胞，只是控制疾病而非治愈疾病，停用TKI将会引起疾病复发[21]。对于Ph−患者，虽然未检测到Ph染色体，但仍需继续应用TKI，而目前停药仅适合于临床试验。

目前有文献报道，在25例出现Ph−CA且进展为骨髓增生异常综合征（MDS）或急性白血病的CML患者中，16例存在−7/7q−，而在出现−7/7q−的Ph−CA患者中约30％进展为MDS或急性白血病[14]，同时Meeus等[22]指出−7/7q−常与治疗相关性MDS和急性髓系白血病（AML）有关。失去全部7号染色体可使髓系细胞增殖和分化异常，但对于CML患者出现−7后的治疗原则目前尚无定论。本研究中2例患者出现−7，其中例4在−7消失时出现了Ph+克隆，这可能与Ph+克隆的出现抑制了其他异常克隆有关，也可能预示着Ph−CA的出现会影响CML患者的转归，因例数较少尚不能得出明确结论，需积累更多病例进一步分析。鉴于−7/7q−常出现于MDS或AML患者的染色体核型中，因此当CML患者出现−7/7q−时，具有高度进展的风险，应密切监测患者遗传学反应和分子生物学反应，一旦丧失已获得的遗传学或分子学反应，需及时调整治疗方案，必要时可行造血干细胞移植。

综上所述，IM、达沙替尼及尼洛替尼治疗CML后均可出现Ph−CA，其中以＋8最常见，因此对CML患者进行细胞遗传学监测是至关重要的，尽管多数Ph−CA可自行消失，但若出现−7/7q−、复杂核型等，需密切监测。