Sensitization by subcutaneous route is superior to intraperitoneal route in induction of asthma by house dust mite in a murine mode.

OBJECTIVE: To develop a new experimental model of chronic allergic pulmonary disease induced by house dust mite, with marked production of specific immunoglobulin E (IgE), eosinophilic inflammatory infiltrate in the airways and remodeling, comparing two different routes of sensitization.
METHODS: The protocol lasted 30 days. BALB/c mice were divided into six groups and were sensitized subcutaneously or intraperitoneally with saline (negative control), Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) 50 or 500 mcg in three injections. Subsequently they underwent intranasal challenge with Der p or saline for 7 days and were sacrificed 24 hours after the last challenge. We evaluated the titration of specific IgE anti-Der p, eosinophilic density in peribronchovascular space and airway remodeling.
RESULTS: Both animals sensitized intraperitoneally and subcutaneously produced specific IgE anti-Der p. Peribronchovascular eosinophilia increased only in mice receiving lower doses of Der p. However, only the group sensitized with Der p 50 mcg through subcutaneously route showed significant airway remodeling.
CONCLUSION: In this murine model of asthma, both pathways of sensitization led to the production of specific IgE and eosinophilia in the airways. However, only the subcutaneously route was able to induce remodeling. Furthermore, lower doses of Der p used in sensitization were better than higher ones, suggesting immune tolerance. Further studies are required to evaluate the efficacy of this model in the development of bronchial hyperresponsiveness, but it can already be replicated in experiments to create new therapeutic drugs or immunotherapeutic strategies.

INTRODUCTION

Asthma is an inflammatory disease of the airways associated with bronchial hyperresponsiveness, which leads to recurring episodes of cough, dyspnea, wheezing, and chest tightness.( The pathogenesis of allergic asthma, which accounts for up to 70% of cases, involves exposure to allergens, the phenomenon of sensitization, and the consequent type I hypersensitivity reaction, mediated by immunoglobulin E (IgE).( However, the immunopathological mechanism, initially mediated by IgE, is a lot more complex, including diverse cells, inflammatory mediators, and cytokines, with a predominance of helper T type 2 lymphocytes (TH2 cells).( The complexity of the pathogenesis of human asthma hinders establishing experimental models with animals that faithfully reproduce the clinical forms found in daily practice.(

An understanding of the pathological mechanisms, of the critical pathways involved, and the targets for new therapeutic strategies would be ideally determined by studies in human beings.( However, due to obvious ethical issues, the studies necessary for such conclusions are not performed in asthmatic subjects.( Hence, the formulation of simple and effective animal models that do not demand high costs is indispensable.

The most commonly used animals in asthma models have been rodents, especially mice and rats, due to their greater availability, cost-effectiveness, and easy manageability.( Most asthma models with mice use ovalbumin as foreign sensitizing protein associated with an adjuvant, especially aluminum hydroxide.( Nevertheless, more recent models have used ovalbumin without adjuvant for sensitization, with results comparable to those of the classic models, with alum.(

The most frequently used route for sensitization is intraperitoneal (IP), generally with two injections, separated by a period of 7 to 14 days, and normally there is a new exposure to the antigenic protein directly in the airway, by inhalator route (aerosol), or intranasal (IN) or intratracheal installation.( However, the clinical significance of models with ovalbumin to mimic human asthma has been questioned. Therefore, models with house dust mites, pollen, cockroaches, or fungi, which are known aeroallergens involved in the pathogenesis of human allergic asthma, have been used.( Aeroallergens have already been studied for sensitization and challenge by different routes and with varied doses.( Our group also demonstrated that different species of mice can present with antagonist responses in dose-response curves of sensitization to the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) in a model of allergic conjunctivitis.( Nevertheless, one of the great difficulties in setting up effective models of asthma has been the chronicity of the process, with development of the disease mediated by IgE, with pulmonary eosinophilia, but that also causes remodeling of the airways.

OBJECTIVE

To develop a new experimental model of the chronic allergic pulmonary disease induced by house dust mite, with prominent production of specific IgE, inflammatory eosinophilic infiltrate in the airways, and remodeling, and to compare the two different sensitization routes and two distinct doses of dust mites in this process.

METHODS

Specific-pathogen-free (SPF) male adult BALB/c strain mice were used, aged six to eight weeks. The animals came from the Central Animal Laboratory of the Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo [Medical School]. The mice were kept in the maintenance animal laboratory of the Laboratórios de Investigação Médica (LIM) [Medical Investigation Laboratories] 05 and 20, with food and water ad libitum. All animals received care as per the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, published at the National Institutes of Health (NIH; publication 85-23, revised in 1985), and all experiments were performed under general anesthesia. The protocol was approved by the Research Ethics Committee of the Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (protocol number 405/11).

The animals were divided into six experimental groups, according to the solutions given during sensitization and challenge, route of sensitization used, and the doses of dust mites applied to the study groups. The six groups are detailed on table 1.

Table 1

Experimental groups according to the sensitization route, substances applied (saline solution or Dermatophagoides pteronyssinus - Der p), and doses applied

Groups	Sensitization (dose and route)	Challenge (10mcL, IN route)	n (initial)	n (final)
SalSC	Saline SC	Saline	6	6
Derp50SC	Der p 50mcg SC	Der p 50mcg	6	6
Derp500SC	Der p 500mcg SC	Der p 50mcg	6	6
SalIP	Saline IP	Saline	5	5
Derp50IP	Der p 50mcg IP	Der p 50mcg	6	5
Derp500IP	Der p 500mcg IP	Der p 50mcg	6	6

IN: intranasal; SC: subcutaneous; IP: intraperitoneal; n: number of mice.

The dust mite studied was the Der p, using lyophilized powder extract (Alergia Clínica Laboratorial e Comércio Ltda., São Paulo, SP, Brazil) diluted in 0.9% saline solution, with no preservative and stored in the refrigerator (4°C). The concentration of the primary allergen (Der p 1 and Der p 2) was 34mcg/mg of extract. For sensitization, the aluminum hydroxide (alum) was used as adjuvant, at the dose of 6mg per application. The study groups received three applications of Der p at the doses of 50mcg (1.7mcg of the primary allergen) or 500mcg (17mcg of the primary allergen), diluted in saline with 6mg alum, with seven-day intervals. The Control Groups received three applications of saline solution with 6mg alum, with the same interval between doses. The volume applied in each injection was 0.2mL (Table 1).

During the challenge phase, the nasal instillations contained 10mcL of the solution, with saline (Control Groups) or Der p at the dose of 50mcg, diluted in 0.9% saline solution.

The protocol for pulmonary sensitization and inflammation induction by dust mite had the duration of 30 days, as is summarized in figure 1. The animals received the injections of the sensitizing agent on days 0.7, and 14, and were submitted to challenges with daily IN instillations between days 22 and 28; they were sacrificed for study on day 29.

Figure 1

Diagram of the protocol for sensitization, challenge, and sacrifice with duration of 30 days (D0 to D29)

The sensitization routes used were subcutaneous (SC) and IP. The SC injections were applied at the base of the tail. The animals were divided into six groups, according to the route of administration and the doses used in sensitization (Table 1). All groups received alum at the dose of 6mg.

The animals received the IN instillations of the study substance daily from day 22 to 28, between 9:00 am and 11:00 am. The SalSC and SalIP groups received 10mcL of the saline solution, while the Derp50SC, Derp500SC, Derp50IP, and Derp500IP groups were submitted to IN administration of 50mcg of Der p, diluted in saline, with a total of 10mcL.

On day 29, 24 hours after the last IN installation, the animals were anesthetized by IP injection of thiopental (70mg/kg) and then underwent tracheostomies. Still under the effect of the anesthetic, the mice were exsanguinated, via dissection of the abdominal aorta, with removal of the lungs for histological examination.

After the collection of the bronchoalveolar lavage, the lungs were removed en bloc to be submitted to histological analysis. The fixation of the material was done with 4% formaldehyde for 24 hours. The material was cut to posteriorly be included in paraffin and stained with hematoxylin-eosin (HE). The slides were analyzed with a common optic microscope for the determination of the mean alveolar diameter, peribronchial infiltrate, and parameters indicative of pulmonary remodeling.

The morphometric analysis was performed with the help of a reticulum with 50 lines and 100 points, with known area, coupled with the optic microscope. Hematoxylin-eosin staining was used to quantify the eosinophils in the peribronchovascular space. The density of eosinophils was determined by counting the number of eosinophils present in the inflammatory infiltrate between the bronchus and the adjacent artery, divided by the number of points, corresponding to the total area of the inflammatory infiltrate, with a magnification of 1,000X. On each slide prepared with tissue from only one animal, five airways were analyzed.

To quantify the collagen fibers present in the peribronchovascular space, the slides were stained with Picrosirius (Direct Red 80, CI 35780, Aldrich, Milwaukee, Wisc., USA). The area of the collagen fibers was measured (mm(2)) in five distal areas, using polarized light with a 400X magnification, with an image analyzing system (Image J, version 1.30).( The collagen area was expressed as a relation between the area of the collagen fibers (mm(2)) and the perimeter of the airway (mm).

Serum from the blood collected by dissection of the abdominal aorta was used for investigation of specific anti-Der p immunoglobulins, by means of the passive cutaneous anaphylaxis (PCA) technique for IgE detection and immunoenzymatic assay (ELISA) for determination of specific anti-Der p IgG1. After blood collection, the samples were immediately centrifuged for 10 minutes (5°C; 3000rpm). Samples of serum were stored at -80°C until the day of the assays.

Passive cutaneous anaphylaxis reaction was used to detect and estimate the levels of IgE specific for Der p, as previously described.( In short, the dorsum of each rat was shaved and 0.1mL of different serum solutions was injected by intradermal route. Three male Wistar rats were used for the PCA, and the serum of each animal was included in the study. After a latent period of 24 hours, the animals were challenged intravenously (IV) with 1mL of 0.5% Evans Blue solution in saline, containing 1,000mcg of the antigen (Der p). The animals were submitted to euthanasia 30 minutes after the injection of the antigen, and the diameter of the blue papules on the internal surface of the skin was measured. The PCA titers were defined as the greatest dilutions that lead to an intradermal allergic reaction greater than 5mm in diameter. The experiments were run in triplicate.

Dosing of the antibodies was done by indirect ELISA. For IgG1, the micro plaque was covered with the antigen Der p. After incubation and washing, the sera were added at a previously determined dilution. To develop the reaction, IgG1-specific detection biotinylated antibodies were added, followed by incubation and washing. Next, the developing solution containing the enzymatic conjugate of streptavidin-peroxidase, substrate, and chromogene were added.

The color reaction was read in a 490nm spectrophotometer and was proportional to the quantity of the immunoglobulins in the sample. The results were expressed as mean absorbance ± standard error of the serial dilutions of the samples of each group.

The statistical analyses were carried out by means of the SigmaStat 10.0 program (Jandel, Calif., EUA). Comparison between the groups was made with the one-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Holm-Sidak method. A p value of less than 0.05 was considered significant.

RESULTS

The protocol proved safe and effective in inducing chronic allergic pulmonary disease. Only one animal from Group 5 died before the 29th day, which was not attributed to respiratory symptoms.

Both the SC and IP sensitization routes were effective in inducing IgE specific for Der p (Figure 2). Both doses of dust mites also lead to the synthesis of specific IgE, with no difference between the two groups sensitized by IP, but with greater titration in the Derp50SC Group (1:80) relative to the Derp500SC Group (1:20), as is shown on figure 2. No animal of the Control Groups (Saline) showed positivity in the investigation of specific IgE (Figure 2).

Figure 2

Values of mean ± standard error of the titration of specific IgE anti-Dermatophagoides pteronyssinus by the passive cutaneous anaphylaxis technique

The IgG1 quantified by ELISA was also detectable at high titers in the four groups submitted to the dust mite, with no difference among them (Figure 3).

Figure 3

Values of mean ± standard error of the titration of specific IgG1 anti-Dermatophagoides pteronyssinus by the immunoenzymatic assay technique (ELISA)

The eosinophilic inflammation in the peribronchovascular space was analyzed by cell density. Evaluating the density of eosinophils in the peribronchovascular space, there was no difference between the two sensitization routes. In the groups sensitized by the SC route, there was an increase in eosinophilia density in the Derp50SC Group relative to the SalSC Group (p=0.049). Among the groups sensitized by IP route, the Der50IP Group had a greater density of eosinophilia than did the SalIP and Derp500IP Groups (p=0.017 and 0.025, respectively). The results of the analysis of eosinophilic density are detailed in figure 4.

Figure 4

Values of mean ± standard error of the eosinophilic density in the peribronchovascular space (hematoxylin-eosin). The density was determined by the count of number of eosinophils present in the inflammatory infiltrate, between the bronchus and the adjacent artery, divided by the number of points corresponding to the total area of the inflammatory infiltrate, with a 1000x magnification

Remodeling of the airways was analyzed by the area of collagen fibers relative to the perimeter of the airway. Only Group Derp50SC had an increase in collagen fibers relative to all other experimental groups. The intraperitoneal route and the 500mcg dose of Der p did not prove effective in inducing remodeling, showing results similar to those in the mice treated only with saline (Figure 5).

Figure 5

Evaluation of airway remodeling by the quantification of collagen fibers stained by Picrosirius. The collagen area (mean ± standard error) was expressed by a ratio of the area of the collagen fibers (in µm2) and the perimeter of the airway (in µm2)

DISCUSSION

Allergic asthma is a highly prevalent disease, especially in Western societies. Over the last years, there has been much progress in the understanding of the immunopathological mechanisms, and animal models have been fundamental in the study of the complex cellular and physiological interactions that occur in the human disease.( Additionally, it is known that sensitization to house dust mites is the primary risk factor for the development of respiratory allergic diseases.( With this, the number of studies published using dust mites in animal models has been increasing, providing a more trustworthy mimicking of the disease found in clinical practice, and a better understanding of its pathological mechanisms.

Several combinations of different routes of sensitization and challenge have already been used in murine models of asthma due to dust mites, including IP, SC, IN sensitization as well as aerosol, IN and intratracheal challenge.( However, few studies were published with a combination of SC sensitization and IN challenge.( The SC and IP routes for sensitization are comparable in models of ovalbumin,( but as far as we know, the present study was the first to compare the SC and IP sensitization route in a model of asthma due to dust mites.

Since asthma is a disease with a TH2 profile, with an IgE-mediated mechanism, the first condition for developing an efficient model of allergic pulmonary disease is an effective sensitization, with synthesis of specific IgE at adequate levels.( We can attain high titers of IgE, mediated by the PCA technique. We also show the formation of high titers of anaphylactic IgG1, corroborating findings of IgE. Additionally, the two sensitization routes (SC and IP) were effective, as well as the two doses studied (50 and 500mcg of Der p per injection). The groups submitted to doses of 50mcg of Der p seem to present with higher levels of specific IgE than the 500mcg groups, particularly in animals sensitized by the SC route, in which we find two different titers, which is considered significant in the PCA technique. In a prior study, our group showed that the increase in dose used in sensitization lead to an increase in IgE in BALB/c mice and decrease in C57Bl/6.( Our results suggest the occurrence of an immunomodulation with the dose of 500mcg administered in three injections.

Another important fact is the participation of eosinophils in the pathogenesis of asthma.( Eosinophils are recruited by cytokines and chemokines to the site of inflammation after degranulation of the mast cells by the allergen-IgE bond and then reach the location of the aggression, cause epithelial damage, increase the inflammatory process, and are considered the primary cause responsible for the persistent inflammatory process in the asthma patient’s airways.( We were able to demonstrate the increase of eosinophilia in the peribronchovascular space after sensitization with 50mcg IP relative to the other groups sensitized via IP. In the groups sensitized via SC, only the group with the lower dose (Derp50SC) showed an increase in eosinophilia in the peribronchovascular space relative to its negative control (SalSC). Once again, the high dose of 500mcg per application in the SC Group may have caused a deviation of the immune response to tolerance.

Nonetheless, the most accentuated difference found in the present study was in regard to the remodeling of the airways. The Derp50SC Group showed a prominent increase in the area of collagen fibers relative to the perimeter of the airways when compared to the other groups. The 500mcg SC dose did not trigger a greater production of collagen fibers, even when compared to the Saline Group. These findings corroborate our hypothesis that the higher doses must have induced regulatory populations, diminishing the production of IgE, the allergic inflammation, and the chronification of the process. Additionally, the IP route of sensitization also did not prove efficient in inducing remodeling, both in the group that received the lower dose (50mcg) and in the group submitted to the 500mcg injections. This shows the importance of more studies such as the one presented here that compare different routes and doses for the induction and sensitization with an aeroallergen. The confirmation that the 50mcg doses were more effective than those at 500mcg not only strengthens the concept of tolerance by high doses, but also allows future studies to be done using smaller quantities of the allergen, with greater cost-efficacy.

CONCLUSION

The model of experimental asthma with duration of 30 days, based on SC sensitization with 50mcg of Der p with aluminum hydroxide, in three applications, followed by a daily nasal challenge with Der p 50mcg in 10mcL of saline for 7 days, and euthanasia 24 hours after the last challenge, was effective in the development of specific IgE and IgG1, eosinophilia in the peribronchovascular space, and airway remodeling. The intraperitoneal route proved less effective in this study than the SC route, and higher doses of dust mites for sensitization (500mcg) were inferior to those of 50mcg, suggesting immunomodulation. More studies are needed to assess the efficacy of this model in the development of airway hyperresponsiveness, but it may be replicated in experiments for establishing new therapeutic strategies with medications or even immunotherapy.

INTRODUÇÃO

A asma é uma doença inflamatória das vias aéreas associada à hiperresponsividade brônquica, que leva a episódios recorrentes de tosse, dispneia, sibilância e opressão torácica.( A patogênese da asma alérgica, que responde por até 70% dos casos, envolve a exposição a alérgenos, o fenômeno da sensibilização e a consequente reação de hipersensibilidade do tipo I, mediada por imunoglobulina E (IgE).( No entanto, o mecanismo imunopatológico, inicialmente mediado por IgE, é muito mais complexo, incluindo diversas células, mediadores inflamatórios e citocinas, com perfil predominante de linfócitos T auxiliares ou helper 2 (TH2).( A complexidade da patogênese da asma humana dificulta a criação de modelos experimentais com animais que reproduzam de forma fidedigna as formas clínicas que encontramos na prática diária.(

A compreensão dos mecanismos patológicos, das vias críticas envolvidas e de alvos para novas estratégias terapêuticas seria idealmente determinada por estudos em seres humanos.( Porém, por questões éticas óbvias, os estudos necessários para tais conclusões não são realizados em asmáticos humanos.( Desse modo, a formulação de modelos animais simples, eficazes e que não demandem custo muito elevado se faz imprescindível.

Os animais mais comumente utilizados em modelos de asma têm sido os roedores, particularmente os camundongos e ratos, pela maior disponibilidade, custo-efetividade e facilidade de manuseio.( A maioria dos modelos de asma com camundongos utiliza a ovalbumina como proteína estranha sensibilizante associada a um adjuvante, notadamente o hidróxido de alumínio.( No entanto, modelos mais recentes vêm utilizando ovalbumina sem adjuvante para sensibilização, com resultados comparáveis aos modelos clássicos, com alume.(

A via mais utilizada para sensibilização é a intraperitoneal (IP), em geral com duas injeções, separadas por um período de 7 a 14 dias e, normalmente, ocorre nova exposição à proteína antigênica diretamente na via aérea, via inalatória (aerossol), instilação intranasal (IN) ou intratraqueal.( Porém tem sido questionada a significância clínica de modelos com ovalbumina para mimetizar a asma humana. Dessa forma, vêm sendo utilizados modelos com ácaros, pólens, baratas ou fungos, que são conhecidos aeroalérgenos envolvidos na patogênese da asma alérgica humana.( Aeroalérgenos já foram estudados para sensibilização e provocação por diferentes vias e com doses variadas.( Nosso grupo já demonstrou, inclusive, que diferentes linhagens de camundongos podem apresentar respostas antagônicas em curvas dose-resposta de sensibilização ao ácaro Dermatophagoides pteronyssinus (Der p) em um modelo de conjuntivite alérgica.( No entanto, uma das grandes dificuldades na montagem de modelos eficazes de asma tem sido a cronicidade do processo, com desenvolvimento de doença IgE mediada, com eosinofilia pulmonar, mas que acarrete também remodelamento das vias aéreas.

OBJETIVO

Desenvolver um novo modelo experimental de doença pulmonar alérgica crônica por ácaro, com proeminente produção de IgE específica, infiltrado inflamatório eosinofílico nas vias aéreas e remodelamento, e comparar duas vias diferentes de sensibilização e duas doses distintas de ácaro neste processo.

MÉTODOS

Foram utilizados camundongos machos adultos, livre de patógenos específicos (SPF, sigla do inglês specific-pathogen-free), da linhagem BALB/c, com idade de 6 a 8 semanas. Os animais foram provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Os camundongos foram mantidos no biotério de manutenção dos Laboratórios de Investigação Médica (LIM) 05 e 20, sob alimentação e água ad libitum. Todos os animais receberam cuidados de acordo com o Guia de Cuidados e Uso de Animais de Laboratório, publicado no National Institutes of Health (NIH; publication 85-23, revisado em 1985), e todos os experimentos foram realizados sob anestesia geral. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (protocolo 405/11).

Os animais foram divididos em seis grupos experimentais, de acordo com as soluções administradas na sensibilização e provocação, a via de sensibilização utilizada e as doses de ácaro aplicadas nos grupos de estudo. Os seis grupos estão detalhados na tabela 1.

Tabela 1

Grupos experimentais de acordo com a via de sensibilização, substâncias aplicadas (salina ou Dermatophagoides pteronyssinus - Der p) e doses aplicadas

Grupos	Sensibilização (dose e via)	Provocação (10mcL, via IN)	n (inicial)	n (final)
SalSC	Salina SC	Salina	6	6
Derp50SC	Der p 50mcg SC	Der p 50mcg	6	6
Derp500SC	Der p 500mcg SC	Der p 50mcg	6	6
SalIP	Salina IP	Salina	5	5
Derp50IP	Der p 50mcg IP	Der p 50mcg	6	5
Derp500IP	Der p 500mcg IP	Der p 50mcg	6	6

IN: intranasal; SC: subcutânea; IP: intraperitoneal; n: número de camundongos.

O ácaro estudado foi o Der p, utilizando-se extrato em pó liofilizado (Alergia Clínica Laboratorial e Comércio Ltda., São Paulo, SP, Brasil), diluído em solução salina 0,9% sem conservante e armazenado em geladeira (4°C). A concentração do alérgeno principal (Der p 1 e Der p 2) era de 34mcg/mg de extrato. Para a sensibilização, foi utilizado como adjuvante o hidróxido de alumínio (alume), na dose de 6mg por aplicação. Os grupos de estudo receberam três aplicações de Der p nas doses de 50mcg (1,7mcg de alérgeno principal) ou 500mcg (17mcg de alérgeno principal), diluídos em salina com alume 6mg, com intervalos de 7 dias. Os Grupos Controles receberam três aplicações de solução salina com alume 6mg, com o mesmo intervalo entre as doses. O volume aplicado em cada injeção foi de 0,2mL (Tabela 1).

Durante a fase de desafio ou provocação, as instilações nasais continham 10mcL da solução, com salina (Grupos Controles) ou Der p na dose de 50mcg, diluído em soro fisiológico 0,9%.

O protocolo de sensibilização pulmonar e indução da inflamação por ácaro teve a duração de 30 dias, conforme esquematizado na figura 1. Os animais receberam as injeções do agente sensibilizante nos dias 0,7 e 14, sendo submetidos às provocações com instilações IN diárias entre os dias 22 e 28 e sacrificados para estudo no dia 29.

Figura 1

Esquema do protocolo de sensibilização, provocação e sacrifício com duração de 30 dias (D0 a D29)

As vias de sensibilização utilizadas foram a subcutânea (SC) e IP. As injeções SC foram aplicadas na base da cauda. Os animais foram divididos em seis grupos, segundo a via e as doses utilizadas na sensibilização (Tabela 1). Todos os grupos receberam alume na dose de 6mg.

Os animais receberam as instilações IN da substância de estudo do dia 22 a 28, diariamente, entre 9h e 11h. Os grupos SalSC e SalIP receberam 10mcL de solução salina, enquanto os grupos Derp50SC, Derp500SC, Derp50IP e Derp500IP foram submetidos à administração IN de 50mcg de Der p, diluído em salina, totalizando 10mcL.

No dia 29, 24 horas após a última instilação IN, os animais foram anestesiados por injeção IP de tiopental (70mg/kg) e, em seguida, traqueostomizados. Ainda sob efeito anestésico, os camundongos foram exsanguinados, via dissecção da aorta abdominal, com remoção dos pulmões para análise histológica.

Após a coleta do lavado broncoalveolar, os pulmões foram removidos em bloco para serem submetidos à análise histológica. A fixação do material foi feita com formaldeído 4%, por 24 horas. O material foi cortado para posteriormente ser incluído em parafina e corado com hematoxilina e eosina (HE). As lâminas foram analisadas em microscópio óptico comum para a determinação do diâmetro alveolar médio, infiltrado peribrônquico e parâmetros indicativos de remodelamento pulmonar.

A análise morfométrica foi realizada com o auxílio de um retículo de 50 retas e 100 pontos, com área conhecida, acoplado à ocular do microscópio ótico. A coloração com HE foi utilizada para quantificação de eosinófilos no espaço peribroncovascular. A densidade de eosinófilos foi determinada pela contagem do número de eosinófilos presentes no infiltrado inflamatório entre o brônquio e a artéria adjacente, dividido pelo número de pontos, correspondendo à área total do infiltrado inflamatório, num aumento de 1.000X. Em cada lâmina preparada com tecido de apenas um animal, cinco vias aéreas foram analisadas.

Para quantificar as fibras de colágeno presentes no espaço peribroncovascular, as lâminas foram coradas com Picrosirius (Direct Red 80, CI 35780, Aldrich, Milwaukee, Wisc., EUA). Foi medida a área de fibras colágenas (mm() em cinco vias aéreas distais, utilizando-se luz polarizada no aumento de 400X, com um sistema analisador de imagem (Image J, versão 1.30).( A área do colágeno foi expressa em uma relação entre a área das fibras colágenas (mm() e o perímetro da via aérea (mm).

O soro do sangue coletado pela dissecção da aorta abdominal foi utilizado para a pesquisa de imunoglobulinas específicas anti-Der p, por meio da técnica da anafilaxia cutânea passiva (PCA - passive cutaneous anaphylaxis) para detecção de IgE e de ensaio imunoenzimático (ELISA) para determinação de IgG1 específicas anti-Der p. Após a coleta do sangue, as amostras foram imediatamente centrifugadas por 10 minutos (5°C; 3000rpm). Amostras do soro foram armazenadas a -80°C até o dia da realização dos ensaios.

A reação da PCA foi usada para detectar e estimar os níveis de IgE específicas para Der p, como descrito previamente.( Brevemente, o dorso de ratos foi depilado e 0,1mL de diferentes diluições do soro foi injetado por via intradérmica. Três ratos machos da linhagem Wistar foram usados para realizar a PCA, e o soro de cada animal foi incluído no estudo. Após um período latente de 24 horas, os animais foram desafiados por via intravenosa (IV) com 1mL de solução de azul de Evans a 0,5% em salina, contendo 1.000mcg do antígeno (Der p). Os animais foram submetidos à eutanásia 30 minutos após a injeção do antígeno e o diâmetro das pápulas azuis na superfície interna da pele foi medido. Os títulos do PCA foram definidos como as maiores diluições que levaram a uma reação alérgica intradérmica maior do que 5mm de diâmetro. Os experimentos foram realizados em triplicata.

A dosagem de anticorpos foi realizada por ELISA indireto. Para determinação de IgG1, a microplaca foi recoberta com antígeno Der p. Após incubação e lavagem, os soros foram adicionados em uma diluição previamente determinada. Para revelar a reação, foram adicionados anticorpos de detecção biotinilados específicos para IgG1, seguido de incubação e lavagem. A seguir, a solução reveladora contendo conjugado enzimático de estreptavidina-peroxidase, substrato e cromógeno foi adicionada.

A reação de cor foi lida em espectrofotômetro a 490nm e foi proporcional à quantidade das imunoglobulinas na amostra. Os resultados foram expressos como a média das absorbâncias ± erro padrão das diluições seriadas das amostras de cada grupo.

As análises estatísticas foram realizadas por meio do programa SigmaStat 10.0 (Jandel, Calif., EUA). A comparação entre os grupos foi feita com análise de variância simples (One Way ANOVA), seguida pelo método Holm-Sidak. Foi considerado significante p menor que 0,05.

RESULTADOS

O protocolo mostrou-se seguro e eficaz na indução da doença pulmonar alérgica crônica. Apenas um animal do Grupo 5 evoluiu a óbito antes do 29º dia, o que não foi imputado a sintomas respiratórios.

Tanto as vias de sensibilização SC como IP foram eficazes na indução da produção de IgE específica para Der p (Figura 2). As duas doses de ácaro utilizadas também levaram à síntese de IgE específica, sem diferença entre os dois grupos sensibilizados por via IP, mas com maior titulação no Grupo Derp50SC (1:80) em relação ao Derp500SC (1:20), como mostrado na figura 2. Nenhum animal dos Grupos Controle (Salina) apresentou positividade na pesquisa de IgE específica (Figura 2).

Figura 2

Valores de média ± erro padrão da titulação da IgE específica anti-Dermatophagoides pteronyssinus pela técnica da passive cutaneous anaphylaxis

A IgG1 quantificada por ELISA também foi detectável em altos títulos nos quatro grupos submetidos ao ácaro, sem diferença entre eles (Figura 3).

Figura 3

Valores de média ± erro padrão da titulação da IgG1 específica anti- Dermatophagoides pteronyssinus pela técnica da ensaio imunoenzimático (ELISA)

A inflamação eosinofílica no espaço peribroncovascular foi analisada pela densidade de células. Avaliando a densidade de eosinófilos no espaço peribroncovascular, não houve diferença entre as duas vias de sensibilização. Nos grupos sensibilizados por via SC, houve aumento da densidade eosinofílica no Grupo Derp50SC em relação ao Grupo SalSC (p=0,049). Entre os grupos sensibilizados por via IP, o Grupo Der50IP teve maior densidade eosinofílica do que os Grupos SalIP e Derp500IP (p=0,017 e 0,025, respectivamente). Os resultados da análise da densidade eosinofílica estão detalhados na figura 4.

Figura 4

Valores de média ± erro padrão da densidade eosinofílica no espaço peribroncovascular (hematoxilina e eosina). A densidade foi determinada pela contagem do número de eosinófilos presentes no infiltrado inflamatório, entre o brônquio e a artéria adjacente, dividido pelo número de pontos correspondendo à área total do infiltrado inflamatório, num aumento de 1000x

O remodelamento das vias aéreas foi analisado pela área de fibras colágenas em relação ao perímetro da via aérea. Apenas o Grupo Derp50SC teve aumento das fibras colágenas em relação a todos os outros grupos experimentais. A via intraperitoneal e a dose de 500mcg de Der p não se mostraram eficazes na indução de remodelamento, tendo resultados semelhantes aos dos camundongos tratados apenas com salina (Figura 5).

Figura 5

Avaliação do remodelamento das vias aéreas pela quantificação de fibras colágenas coradas por Picrosirius. A área do colágeno (média ± erro padrão) foi expressa em uma relação entre a área das fibras colágenas (em µm2) e o perímetro da via aérea (em µm2)

DISCUSSÃO

A asma alérgica é uma doença de alta prevalência, especialmente nas sociedades ocidentais. Nos últimos anos, houve muito progresso na compreensão dos mecanismos imunopatológicos, e os modelos animais têm sido fundamentais no estudo das complexas interações celulares e fisiológicas que ocorrem na doença humana.( Além disso, sabe-se que a sensibilização aos ácaros da poeira é o principal fator de risco para desenvolvimento de doenças alérgicas respiratórias.( Com isso, vem aumentando o número de trabalhos publicados utilizando ácaros em modelos animais, de modo a mimetizar de forma mais fidedigna a doença encontrada na prática clínica e compreender melhor seus mecanismos patológicos.

Várias combinações de diferentes vias de sensibilização e provocação já foram utilizadas em modelos murinos de asma por ácaros, entre elas sensibilização por via IP, SC, IN e provocação aerossol, IN e intratraqueal.( Porém poucos foram os estudos publicados com a combinação de sensibilização SC e provocação IN.( As vias SC e IP para sensibilização são comparáveis em modelos de ovalbumina,( mas, até onde sabemos, o presente estudo foi o primeiro a comparar as vias de sensibilização SC e IP em um modelo de asma por ácaro.

Como a asma é uma doença de perfil TH2, com mecanismo IgE-mediado, a primeira condição para desenvolver um modelo eficiente de doença pulmonar alérgica é uma sensibilização eficaz, com síntese de IgE específica em níveis adequados.( Conseguimos altos títulos de IgE, medidos pela técnica de PCA. Mostramos também formação de altos títulos de IgG1 anafilática, corroborando achados da IgE. Além disso, as duas vias de sensibilização (SC e IP) foram eficazes, bem como as duas doses estudadas (50 e 500mcg de Der p por injeção). Os grupos submetidos a doses de 50mcg de Der p parecem ter apresentado níveis mais elevados de IgE específico do que os grupos 500mcg, particularmente nos animais sensibilizados por via SC, nos quais encontramos diferença de duas titulações, o que é considerado significante na técnica de PCA. Em estudo prévio, nosso grupo demonstrou que o aumento da dose utilizada na sensibilização levava a aumento da IgE em camundongos BALB/c e diminuição em C57Bl/6.( Nossos resultados sugerem a ocorrência de uma imunomodulação com a dose de 500mcg administrada em três injeções.

Outro dado importante é a participação do eosinófilo na patogênese da asma.( O eosinófilo é recrutado por citocinas e quimiocinas para o sítio da inflamação após a desgranulação do mastócito ativado pela ligação alérgeno-IgE e, depois de chegar ao local da agressão, causa dano epitelial, aumento do processo inflamatório e é considerado o principal responsável pelo processo inflamatório persistente na via aérea do asmático.( Conseguimos demonstrar o aumento da eosinofilia no espaço peribroncovascular após a sensibilização com 50mcg IP em relação aos outros grupos sensibilizados via IP. Nos grupos sensibilizados por via SC, apenas o de dose menor (Derp50SC) apresentou aumento da eosinofilia peribroncovascular em relação ao seu controle negativo (SalSC). Mais uma vez, a dose elevada de 500mcg por aplicação no Grupo SC pode ter acarretado desvio da resposta imune para tolerância.

No entanto, a diferença mais marcante encontrada no presente estudo se deu em relação ao remodelamento das vias aéreas. O Grupo Derp50SC apresentou um aumento proeminente da área de fibras colágenas em relação ao perímetro das vias aéreas quando comparado aos outros grupos. A dose de 500mcg por via SC não desencadeou maior produção de fibras colágenas nem mesmo em comparação ao Grupo Salina. Esses achados corroboram nossa hipótese de que as doses mais altas devem ter induzido populações regulatórias, diminuindo a produção de IgE, à inflamação alérgica e à cronificação do processo. Além disso, a via de sensibilização IP também não se mostrou eficiente na indução de remodelamento, tanto no grupo que recebeu a dose menor (50mcg) como no que foi submetido às injeções de 500mcg. Isso mostra a importância de mais estudos como o aqui apresentado, que comparem vias e doses diferentes para induzir à sensibilização com aeroalérgeno. A comprovação de que as doses de 50mcg foram mais eficazes que as de 500mcg não só fortalece o conceito de tolerância por altas doses, mas permite que estudos futuros sejam realizados utilizando menores quantidades de alérgeno, com maior custo-eficácia.

CONCLUSÃO

O modelo de asma experimental com duração de 30 dias, baseado na sensibilização SC com 50mcg de Der p com hidróxido de alumínio, em três aplicações, seguidas por provocação nasal diária com Der p 50mcg em 10mcL de salina por 7 dias, e sacrifício após 24 horas do último desafio foi eficaz no desenvolvimento de IgE e IgG1 específicas, eosinofilia no espaço peribroncovascular e remodelamento das vias aéreas. A via intraperitoneal mostrou-se menos eficaz neste estudo do que a SC e doses mais elevadas de ácaro para sensibilização (500mcg) foram inferiores às de 50mcg, sugerindo imunomodulação. Mais estudos são necessários para avaliar a eficácia deste modelo no desenvolvimento da hiperresponsividade das vias aéreas, mas ele pode ser replicado em experimentos para criação de novas estratégias terapêuticas com medicamentos ou mesmo imunoterapia.