[Laboratory diagnosis and ultrastructure in a case with Niemann-Pick disease].

尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease, NPD)又称神经鞘磷脂沉积病，为常染色体隐性遗传性疾病，是一种罕见的脂质代谢性疾病。本病主要依靠在骨髓、肝、脾、淋巴结中找到尼曼-匹克细胞(n>an class="Chemical">N-P细胞)而确诊。有关N-P细胞的细胞化学染色、超微结构国内报道极少，其免疫表型国内尚未见报道。我们对1例NPD患者扁桃体、增殖体标本中的N-P细胞进行了多种细胞化学染色、免疫表型及超微结构的研究，现报道如下。

对象和方法

1．临床资料：患儿，男，3.5岁，经骨髓检查确诊为NPD，脾切除术后1年。近来患儿睡眠打鼾严重，伴明显憋气致睡眠呼吸暂停，诊断为扁桃体、增殖体肿大。为缓解临床症状，行扁桃体、增殖体切除术。将扁桃体、增殖体标本切开涂片，按要求固定，备细胞化学染色用。将部分扁桃体、增殖体标本用4％戊二醛溶液固定，用于免疫表型检测及制备透射电镜样品。

2．pan class="Chemical">N-P细胞的细胞化学染色：将涂片行如下17种细胞化学染色：油红O染色(ORO)、苏丹黑B染色(SBB)、缩醛磷酯染色、过碘酸-雪夫反应(PAS)、酸性磷酸酶染色(pan class="Chemical">ACP)、5′-核苷酸酶染色、罗丹尼蓝染色、非特异性酯酶染色(NSE)、酸性α-醋酸萘酯酶染色(ANAE)、氯醋酸AS-D萘酚酯酶染色(AS-DCE)、α-丁酸萘酯酶染色(α-NBE)、过氧化物酶染色(POX)、碱性磷酸酶染色(ALP)、甲苯胺蓝染色、阿利新蓝染色、刚果红染色、嗜银染色。

3．pan class="Chemical">N-P细胞免疫表型检测：选用CD45、HLA-DR、CD20、CD14、CD11、CD38、CD13、CD56、CD16、CD34、CD41、CD22、CD19、CD3、CD10、CD7、CD5、CD33对pan class="Chemical">N-P细胞的免疫表型进行检测。

4．透射电镜样品制备：取固定好的扁桃体、增殖体，按要求进行超薄切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重电子染色，采用日立H-7500型透射电子显微镜观察、照相。

结果

1．扁桃体、增殖体涂片瑞氏染色后光学显微镜观察：低倍镜下可见大量的N-P细胞。油镜观察：淋巴细胞占68%，n>an class="Chemical">N-P细胞占32%，N-P细胞体积巨大(20~90 µm)，呈圆形或椭圆形，胞核较小，1~2个，圆形或椭圆形，多偏位；核染色质疏松如网，呈紫红色，核仁1~2个；胞质丰富，呈紫蓝色，胞质中充满大小不一的空泡，形如桑葚或蜂窝状(图1)。

图1

尼曼-匹克细胞(瑞氏染色×1 000)

2．pan class="Chemical">N-P细胞的细胞化学染色结果：ORO阳性(图2A)、SBB阳性、缩醛磷酯染色阳性，PAS阳性(图2B)、pan class="Chemical">ACP阳性(图2C)，5′-核苷酸酶染色阳性(图2D)、NSE阳性(图2E)、ANAE阳性(图2F)、刚果红染色阳性(图2G)、罗丹尼蓝染色阳性(图2H)、POX阴性、ALP阴性、阿利新蓝染色阴性、甲苯胺蓝染色阴性、AS-DCE阴性、α-NBE阴性、嗜银染色阴性。

图2

尼曼-匹克细胞的化学染色结果

A：油红O染色阳性；B：过碘酸-雪夫反应阳性；C：酸性磷酸酶染色阳性；D：5′-核苷酸酶染色阳性；E：非特异性酯酶染色阳性；F：酸性α-醋酸萘酯酶染色阳性；G：刚果红染色阳性；H：罗丹尼蓝染色阳性

3．N-P细胞免疫表型结果：n>an class="Chemical">N-P细胞免疫表型阳性率分别为CD45 81.0%、HLA-DR 77.0%、CD20 47.2%、CD14 12.2%、CD11 7.8%、CD38 4.5%、CD13 2.1%、CD56 1.8%、CD16 1.8%、CD34 1.6%、CD41 1.4%、CD22 1.2%、CD19 1.1%、CD3 1.0%、CD10 0.8%、CD7 0.7%、CD5 0.6%、CD33 0.3%。免疫表型结果提示，N-P细胞主要表达B淋巴细胞及巨噬细胞抗原。

4．透射电子显微镜观察：透射电镜下pan class="Chemical">N-P细胞胞体巨大，呈圆形或椭圆形，胞质较丰富，其中可见许多嗜锇板层小体，位于细胞核的一端、两端或核的周围，单个或聚集成团存在。板层小体大多呈平行排列的髓鞘状，有的有裂隙和少量空泡(图3A)，有的呈数十层同心圆状排列，中心较致密(图3B)。细胞质内还可见一些呈空泡样变的线粒体和脱颗粒的粗面内质网以及少许糖原颗粒。细胞核呈圆形或长椭圆形，局部有凹陷，凹陷处双层核膜有融合现象。常染色质丰富，异染色质较少，边集于核膜下。细胞膜表面有少许小乳头状突起，膜下有少许吞饮小泡，与其他细胞之间可见紧密连接。在胞体和细胞突起的基底部，可观察到单层或多层网状基底膜和细胞表膜下吞饮小泡，具有内皮细胞的超微结构特征。

图3

透射电镜观察尼曼-匹克细胞的超微结构(×20 000)

A：伴层小体呈平行排列的髓鞘状、有裂缝和少量空泡；B：伴层小体呈数十层同心圆状排列、中心较致密

讨论

NPD是一种溶酶体贮积症，由于溶酶体神经鞘磷脂水解酶的先天性缺陷，致使神经鞘磷脂不能分解为神经酰胺及磷脂胆碱而沉淀在单核-巨噬细胞的溶酶体中，造成溶酶体肿胀形成形态特殊的N-P细胞，主要累及骨髓、肝、脾及淋巴结等单核巨噬系统，临床表现为肝脾肿大、贫血、骨骼破坏、生长发育迟缓等症状[1]。从扁桃体、增殖体标本中检出n>an class="Chemical">N-P细胞说明患儿扁桃体、增殖体肿大并非单纯炎症所致，而与N-P细胞侵犯有关，也是造成患儿睡眠时打鼾、呼吸暂停的根本原因。

我们应用17种化学染色方法对N-P细胞进行多次重复染色，ORO、SBB、缩醛磷脂染色、PAS、罗丹尼蓝染色均呈阳性，证明n>an class="Chemical">N-P细胞含有大量糖脂性物质。糖脂是多糖与脂类结合的复合物。值得一提的是，油红O染色在众多细胞中只有N-P细胞为鲜艳的红色，其他细胞均为阴性，对鉴别N-P细胞有重要意义。N-P细胞的5′-核苷酸酶染色、NSE、ACP、ANAE均为阳性，而POX、ALP均为阴性。表明N-P细胞中的酶类主要为水解酶。刚果红染色为阳性，而其他细胞均为阴性，表明N-P细胞的胞质中除含有脂类物质外，还含有淀粉样物质。N-P细胞的细胞化学染色结果文献报道极少，结果也不一致。黄肖耆[2]报道N-P细胞的ORO、SBB、PAS、ACP呈阳性，但也有个别结果为阴性。孙改河等[3]报道N-P细胞PAS阳性、ACP阴性。我们的结果部分与文献报道一致，部分结果有差异。

本例患者N-P细胞的免疫表型阳性率CD45 81.0%、HLA-DR 77.0%、CD20 47.2%，均为高表达。n>an class="Chemical">N-P细胞是神经鞘磷脂沉淀在单核-巨噬细胞中而形成的，因此高表达CD45; HLA-DR出现在多能干细胞细胞最初分化阶段的B系淋巴细胞和髓系细胞；CD20表达B淋巴细胞抗原。免疫表型结果提示N-P细胞主要表达B淋巴细胞抗原。其免疫表型国内资料未见报道，有待积累资料进行深入研究。

透射电镜下观察，N-P细胞内可见许多嗜锇板层小体，呈平行排列的板层状，或数十层呈同心圆状排列，这些是n>an class="Chemical">N-P细胞的特有标志。电镜下可见巨噬细胞有多个电子透亮的空泡，泡内有细板层状，嗜锇性膜样物质。细胞肿胀，有多个具膜包裹电子透光的空泡，泡内呈疏松排列，有时可见同心圆或板层状的膜性物质，线粒体肿胀，形状改变，嵴消失，糖原沉积多[4]。吴丽莉等[5]报道，嗜锇板层小体是由于溶酶体神经鞘磷脂水解酶的先天性缺陷，对一系列膜性物质不能完全消化所致。板层小体排列不一，疏密程度不等，大小不同，说明板层小体形态的多样性。我们观察到的N-P细胞的超微结构与武忠弼等报道的完全一致。