[Control study of melphalan instead of cyclophosphamide as a myeloablative conditioning regimen for allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for treatment of myeloid malignancies].

OBJECTIVE: To evaluate melphalan instead of cyclophosphamide in modified busulfancyclophosphamide regimen as a new myeloablative conditioning regimen for the treatment of myeloid malignancies patients receiving allogeneic hematopoietic stem cell transplantation （HSCT）.
METHODS: The clinic data of 94 myeloid malignancies patients undergoing allogeneic HSCT were analyzed, of which 48 patients received Bu+Cy+Flu+Ara-C, 46 cases Bu+Mel+Flu+Ara-C regimens. Rregimen-related toxicity, engraftment, graft- versus-host disease（GVHD）, infection condition, non- relapse mortality, and overall survival were compared between the two groups.
RESULTS: All patients achieved neutrophil engraftment. The incidence of grade Ⅲ-Ⅳ oral mucositis and diarrhea in BMFA group was higher than in BCFA group（P<0.05）. The incidence of acute GVHD in BMFA group was also higher than in BCFA group but without statistically significant difference（36.5% over 56.5%, P=0.100）. With a median follow up of 42 months, the incidence of no relapse mortality in BCFA group was 12.5% and 19.6% in BMFA group（P=0.400）. The relapse rate in BMFA group（4.3%）was significantly lower than in BCFA group （25.0%, P=0.009）. The overall survival rates were（71.8±6.7）% and（76.1±6.3）%（P=0.852）, and diseasefree survival rates were（67.8±8.9）% and（76.1±6.3）%（P=0.567）were comparable between BCFA group and BMFA group.
CONCLUSION: Melphalan instead of cyclophosphamide as a new myeloablative conditioning regimen had lower relapse and satisfied disease-free survival rates, but the risk of regimenrelated toxicity and GVHD should be taken into consideration.

异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前治愈多种血液系统恶性疾病的重要手段，移植前预处理具有降低肿瘤负荷及清除免疫屏障的重要作用，是移植成败的关键。目前我中心allo-HSCT治疗恶性髓系血液病预处理常用BCFA方案[白消安(Bu)＋环磷酰胺(Cy)＋氟达拉滨(Flu)＋阿糖胞苷(Ara-C)]，与经典Bu/Cy方案相比，髓外毒性及移植物抗宿主病(GVHD)发生率低[1]，但Cy仍存在较明显的心脏毒性并易致出血性膀胱炎。本研究我们采用马法兰(Mel)替代BCFA方案中的Cy，并设计临床资料匹配BCFA方案对照组。通过长期随访，对其疗效及安全性进行前瞻性随机对照研究。

病例和方法

1．病例：选取我中心2009年12月至2012年2月进行allo-HSCT的恶性髓系血液病患者94例，原发病包括急性髓系白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)及慢性髓性白血病(CML)。CML包括慢性期、加速期、急变期患者。将患者随机分为两组，48例采用BCFA方案预处理，男28例，女20例，中位年龄33(9~52)岁，其中AML 32例、MDS 6例、CML 10例；46例采用Bu+Mel+Flu+Ara-C(BMFA)方案预处理，男28例，女18例，中位年龄34(13~48)岁，其中AML 32例、MDS 9例、CML5例。两组患者一般情况比较，差异无统计学意义(P值均> 0.05)。本研究获我院伦理委员会批准。

AML患者参考2009年美国国立综合癌症网络(NCCN)标准，根据细胞遗传学及分子学异常进行危险度分组：①预后良好组：inv(16)、t(8;21)、t(16;16)、细胞遗传学正常伴孤立的NPM1突变；②预后中等组：正常核型、单纯+8、单纯t(9; 11)、其他非良好和不良的异常，t(8;21)、inv(16)患者伴c-Kit突变；③预后不良组：复杂核型(≥3种异常)、−5、−7、5q−、7q−、除t(9;11)以外的11q23异常、t(3;3)、t(6;9)、t(9;22)，细胞遗传学正常伴FLT3/ITD突变。两组患者疾病亚型、移植前患者疾病状态、分子遗传学预后分组比较差异无统计学意义(P值均>0.05)。

2．供者情况：BCFA组供者来源HLA同胞全相合36例，HLA同胞单倍体相合3例，无关供者9例；BMFA组HLA同胞全相合26例，HLA同胞单倍体相合5例，无关供者15例，两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。供者采用G-CSF 5~10 µg·kg−1·d−1进行动员，5 d后采集供者的外周血干细胞。采集后的细胞悬液进行单个核细胞(MNC)计数和CD34+细胞计数。采集1~2 d以获得足够数量细胞。按患者体重计算，BCFA组回输MNC中位数为7.00(2.93~14.20)× 108/kg，CD34+细胞中位数为2.53(1.42~5.48)×108/kg；BMFA组回输MNC中位数为6.43 (3.86~11.70)×108/kg，CD34+细胞中位数为2.81(1.88~6.88)×108/kg。两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

3．预处理方案：BCFA方案：Bu 3.2 mg·kg−1 ·d−1，静脉滴注，−9、−8、−7 d; Cy 50 mg·kg−1·d−1，−6、−5 d；Flu 30 mg·m−2·d−1，−4、−3、−2 d；Flu输注完毕后4 h开始滴注Ara-C，剂量为2 g·m−2·d−1，3~4 h内输注完毕。BMFA方案：Bu、Flu及Ara-C用法与BCFA方案相同，Mel代替Cy，剂量为140 mg·m−2·d−1，−5 d。HLA同胞单倍体及无关供者加用兔抗人胸腺细胞球蛋白(ATG，法国赛达公司产品)，剂量为2.0~2.5 mg·kg−1 ·d−1，−8、−7、−6、−5 d。预处理相关不良反应依据WHO制定的化疗急性和亚急性不良反应分级标准判断[2]，在预处理开始至+28 d内进行评分。

4．GVHD的预防：以短疗程甲氨蝶呤(MTX)+他克莫司(Tac)或环孢素(CsA)预防GVHD。移植前1 d开始静脉滴注Tac (0.03 mg·kg−1 ·d−1)或CsA(2 mg·kg−1 ·d−1)，胃肠道症状消失后改为口服，维持Tac血药浓度为10~20 µg/L，CsA血药浓度为200~400 µg/L，+100 d根据情况逐渐减量，移植后6~12个月停用。MTX于+1、+3和＋6 d给予，用量分别为15、10和10 mg/m2。HLA同胞单倍体及无关供者＋11 d增加1次MTX，用量为10 mg/m2，并于预处理化疗开始起口服霉酚酸酯(MMF)预防GVHD。出现Ⅱ度及以上急性GVHD (aGVHD)后加用甲泼尼龙或联用巴利昔单抗、输注间充质干细胞等治疗。

5．植入及嵌合状态分析：植活标准为患者外周血中性粒细胞绝对值(ANC)>0.5×109/L，并持续3 d以上，停止血小板输注后PLT>20×109/L，并持续7 d以上。采用PCR检测可变数目串联重复序列和原发病特异性融合基因，采用FISH检测性染色体，采用流式细胞仪检测微小残留病以监测植入情况、嵌合状态及复发倾向。

6．随访：随访截至2014年9月1日。中位随访时间为42(2~57)个月，其中BCFA组中位随访39(2~57)个月，BMFA组中位随访时间45(2~55)个月。通过门诊、住院及电话进行随访，主要观察患者缓解及生存情况。总生存(OS)定义为确诊至患者死亡或随访终点。无病生存(DFS)定义为患者获得完全缓解至复发、死亡或随访终点。

7．统计学处理：采用SPSS 19.0统计软件，计数资料用χ2检验，例数较少者采用Fisher精确概率法检验，计量资料采用t检验、秩和检验。生存分析采用Kaplan-Meier生存曲线，率的比较采用Log-rank检验。相关性分析采用Logistic回归。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1．预处理相关不良反应：两组患者预处理相关不良反应见表1，最常见的预处理不良反应为口腔溃疡、腹泻及肝功能异常。BMFA组Ⅲ～Ⅳ度口腔溃疡以及腹泻发生率均显著高于BCFA组(P值均< 0.05)。心功能损害和相关出血性膀胱炎的发生率BCFA组高于BMFA组，分别为16.7％对10.9％以及6.3％对0。未观察到预处理相关的肺部、中枢神经系统及外周神经系统毒性。

表1

两组患者预处理相关毒性比较[例数(％)]

组别	例数	口腔溃疡		腹泻		肝功能异常		心功能损害		出血性膀胱炎
		Ⅰ～Ⅱ度	Ⅲ～Ⅳ度	Ⅰ～Ⅱ度	Ⅲ～Ⅳ度	Ⅰ～Ⅱ度	Ⅲ～Ⅳ度	Ⅰ～Ⅱ度	Ⅲ～Ⅳ度	Ⅰ～Ⅱ度	Ⅲ～Ⅳ度
BCFA组	48	25(52.1)	7(14.6)	21(43.8)	3(6.3)	27(56.3)	2(4.2)	7(14.6)	1(2.1)	3(6.3)	0
BMFA组	46	14(30.4)	20(43.5)a	27(58.7)	11(23.9)	30(65.2)	6(13.0)	4(8.7)	1(2.2)	0	0
P值		0.443		0.001		0.061		0.416		0.256

注：B：白消安；C：环磷酰胺；F：氟达拉滨；A：阿糖胞苷；M：马法兰；与BCFA组比较，a P<0.05

2．造血功能重建：BCFA组和BMFA组ANC> 0.5×109/L中位时间分别为15(12~21) d和14(11~22) d(P=0.010)。BCFA组PLT>20×109/L的中位时间为21(12~99) d, 1例患者移植后因肺感染死亡，未获得血小板重建。BMFA组PLT>20×109/L的中位时间为19(11~50)d (P=0.088)，3例患者于移植后分别因严重肺感染、颅内出血及aGVHD死亡，未获得血小板重建。

3．感染：细菌感染及拟诊真菌感染发生率两组患者差异无统计学意义。巨细胞病毒(CMV)血症及EB病毒(EBV)血症BCFA组为12例，BFMA组为23例(P=0.012)。

4．GVHD发生情况：移植后100 d内，BCFA组中19例患者发生aGVHD(39.6%)，其中Ⅰ~Ⅱ度16例(33.3%)，Ⅲ~Ⅳ度3例(6.3%)；BMFA组26例(56.5%)患者发生aGVHD (P=0.100)，其中Ⅰ~Ⅱ度22例(47.8%) (P=0.152)，Ⅲ~Ⅳ度4例(8.7%) (P= 0.651)，此组经治疗无效死亡4例。BCFA组发生cGVHD 18例，其中局限型12例，广泛型6例(12.8%)，其中2例死于重度cGVHD合并肺感染；BMFA组发生cGVHD 16例(P=0.784)，其中局限型8例，广泛型8例(17.8%) (P=0.506)，均表现为皮肤、眼及肝脏、肺脏受累，接受皮质醇激素为主的治疗后均获得控制。

5．生存及复发情况：BCFA组非复发死亡(NRM) 6例(12.5%)，其中3例死于肺感染，1例死于多脏器功能衰竭，2例死于cGVHD合并肺感染；BMFA组NRM 9例(19.6%) (P=0.400)，4例死于aGVHD，3例死于肺感染，1例死于急性心功能衰竭，1例死于脑出血。BMFA组复发率(RR)明显低于BCFA组，3年RR分别为25.0％和4.3% (P= 0.009)。BCFA组与BMFA组的3年OS率分别为(71.8±6.7)％和(76.1±6.3)% (P=0.852)，DFS率分别为(67.8±8.9)％和(76.1±6.3)% (P=0.567)，BMFA组略高于BCFA组，但差异无统计学意义。

我们将两组患者根据年龄≥或<35岁进行分层比较，结果见表2。其中年龄≥35岁应用BCFA方案预处理患者累积RR为42.9%，与同组年龄<35岁患者以及年龄≥35岁应用BMFA方案预处理患者比较差异均有统计学意义(P=0.023，0.007)。

表2

年龄≥或<35岁的两组患者无病生存率及复发率比较

组别	例数	无病生存率(％)			复发率(％)
		BCFA组	BMFA组	P值	BCFA组	BMFA组	P值
年龄≥35岁	44	61.5 ± 10.7	73.9±9.2	0.594	42.9	4.3	0.007
年龄<35岁	50	72.6±9.0	78.3±8.6	0.760	11.1	4.3	0.403
P值		0.428	0.655		0.023	0.975

注：B：白消安；C：环磷酰胺；F：氟达拉滨；A：阿糖胞苷；M：马法兰

6．影响DFS的因素：对两组患者分别进行多因素分析，结果显示，供受者的年龄，供受者血型、性别相合与否，移植回输MNC数及CD34+细胞数，GVHD预防方案，是否为广泛型cGVHD对两组患者DFS均无显著影响。在BCFA预处理组患者中，无关供者及HLA不全相合同胞供者移植为降低DFS的危险因素(HR=2.823，95%CI 0.997~7.998，P= 0.05)；而BMFA预处理组患者中，aGVHD的发生则为降低DFS的危险因素(HR=3.150，95%CI 1.752~5.663，P=0.001)。

我们对两组患者aGVHD发生的危险因素进行了多因素分析，预处理相关Ⅲ~Ⅳ度口腔溃疡与BMFA组患者aGVHD的发生具有显著相关性(HR= 6.796，95%CI 1.032~44.753，P=0.046)，而供受者年龄，供受者血型、性别是否相合，移植回输MNC数及CD34+细胞数，GVHD预防方案，预处理相关腹泻、肝功能异常等与两组患者aGVHD的发生均无显著相关性。

讨论

Mel是一种具有广谱抗肿瘤活性的双功能烷化剂，广泛应用于多发性骨髓瘤、淋巴瘤自体造血干细胞移植前的预处理，也应用于急性淋巴细胞白血病以及复发难治AML的挽救性自体移植。嘌呤类似物则可能阻断烷化剂导致的DNA损伤的修复机制，所以很多研究将Flu与Mel联合作为髓系恶性血液病减低剂量造血干细胞移植的预处理方案[3]。而且Mel与Bu临床毒性不相重叠，并具有良好的中枢神经系统渗透性[4]。因此我们将Mel与Bu、Flu及Ara-C组成清髓性预处理方案，以期取得较好的耐受性和较低的TRM率以及较低的RR。

我们的结果显示，两种预处理方案虽然OS和DFS率差异无统计学意义，但在造血重建、预处理相关不良反应、aGVHD、RR等方面差异有统计学意义。在造血重建方面，BMFA组造血重建、尤其是粒细胞植入早于BCFA组患者。国外很多研究中，包含Mel的预处理方案也获得了较为理想的造血重建速度[5]–[6]。在预处理相关不良反应方面，虽然我们在预处理期间应用口腔低温治疗预防口腔黏膜炎的发生，BMFA组发生口腔黏膜炎、腹泻的病例数及严重程度仍高于BCFA组。BMFA组中预处理相关出血性膀胱炎及心脏毒性的发生率低于BCFA组。结果提示，应用Mel虽然避免了Cy导致的不良反应，但增加了预处理相关黏膜损伤的发生率。

aGVHD的发生和严重程度受包括HLA相合程度、供者来源、供受者年龄、干细胞来源、患者移植前HBsAg阳性[7]等多种因素影响。国内研究分析了不同程度aGVHD对预后的影响，结果表明aGVHD程度越重其预后越差[8]。研究表明，预处理相关不良反应造成的器官损害是引起GVHD的重要原因，这可能与组织损伤所产生的炎症细胞因子环境相关[9]，包含Mel的预处理方案可能增加预处理化疗的组织损伤效应，特别是消化道黏膜损伤所致细胞因子释放进一步增强了免疫反应，导致较为严重aGVHD的发生[10]–[11]。在国外一些研究中，包含Mel的预处理组较对照组具有较高的aGVHD发生率及TRM率[12]–[13]。本研究中，两组HLA配型情况及预防GVHD方法相似，但与BCFA组相比，BMFA组患者aGVHD发生率、尤其Ⅱ度以上aGVHD发生率均较高，但差异无统计学意义。可是我们注意到，在BMFA组中发生Ⅱ度以上aGVHD的患者均因治疗无效死亡，提示BMFA组患者aGVHD严重程度以及致死率更高。而且，BMFA组aGVHD的发生为降低本组患者DFS的独立危险因素，并且采用本预处理方案的患者若发生Ⅲ~Ⅳ度口腔溃疡也可能预示其具有更高的aGVHD发生率。

在感染方面，两组患者的血流感染及真菌感染发生率差异无统计学意义，但BMFA组患者CMV及EBV感染率显著高于BCFA组，这可能与本组患者移植后aGVHD发生率高，应用大剂量免疫抑制剂相关。免疫抑制剂及大剂量糖皮质激素的长期应用造成免疫抑制状态时间延长，增加了移植后机会感染的发生率。陈瑶等[7]的临床研究也显示，aGVHD与移植后CMV感染的发生密切相关。

复发是导致移植失败的主要原因之一。包含Mel的预处理方案虽然具有更大的组织毒性，但可能也对恶性血液病有更强的抗肿瘤作用。de Lima等[13]研究中Flu+Mel预处理组虽较对照组具有较高的TRM率，但是RR明显降低。Kobos等[14]采用Bu+Mel+Flu预处理方案5年DFS率为63%，而RR仅为19%。Bueno等[5]研究中以Bu+Mel方案进行清髓预处理，报道的3年OS率为47%，全部获得DFS，并且研究中发生Ⅱ度以上aGVHD患者OS率为85.7%，高于其他患者，可能为同时产生移植物抗白血病(GVL)效应所致。我们的研究中，BMFA组的RR显著低于BCFA组(4.3％对25.0%)，取得了较好的治疗效果。所以，BMFA预处理组移植后3年OS、DFS率均高于BCFA组，因此包含Mel的预处理方案在降低疾病复发率以及提高DFS率上具有更大优势。

包含Mel的预处理方案虽然有较广泛的组织毒性和较高的aGVHD发生率，但由于其造血重建较快，并且具有良好的抗肿瘤作用，很多国外研究在Mel联合Flu的预处理方案中添加阿伦单抗预防GVHD，并取消回输后应用小剂量甲氨蝶呤预防GVHD，以减轻黏膜损伤，较好地降低了GVHD发生率。这可能是由于阿伦单抗对于供者及受者的抗原提呈细胞以及T细胞、B细胞具有不同作用。但与此同时，此方案也可能产生更严重的免疫抑制，增加原发病的复发和机会性感染的发生[15]–[17]。

综上所述，以Mel替代BCFA方案中的Cy的预处理方案在降低原发病RR、提高DFS率方面具有优势，而是否提高OS率则有待更大规模研究进一步明确。然而，预处理相关不良反应及严重GVHD成为此预处理方案的一个制约因素，临床应用中应注重预处理相关不良反应及GVHD的预防和干预。