Functional and biochemical characteristics of urinary bladder muscarinic receptors in long-term alloxan diabetic rats.

OBJECTIVE: To re-examine the function of the urinary bladder in vivoas well as to determine the functional and biochemical characteristics of bladder muscarinic receptors in long-term alloxan-induced diabetes rats.
METHODS: Two-month-old male Wistar rats were injected with alloxan and the animals showing blood glucose levels >300mg/dL together with age-paired untreated animals were kept for 11 months. Body weight, bladder weight, blood glucose, and urinary volume over a period of 24 hours were determined in both groups of animals. A voiding cystometry in conscious control and diabetic rats was performed to determine maximal micturition pressure, micturition contraction interval and duration as well as voided and post-voiding residual volume. In addition, concentration-response curves for bethanechol in isolated bladder strips, as well as [3H]-N methyl-scopolamine binding site characteristics in bladder homogenates were determined.
RESULTS: Mean bladder weight was 162.5±21.2mg versus 290±37.9mg in control and treated animals, respectively (p<0.05). Micturition contraction amplitude (34.6±4.7mmHg versus 49.6±2.5mmHg), duration (14.5±1.7 seconds versus 23.33±4.6 seconds) and interval (87.5±17.02 seconds versus 281.11±20.24 seconds) were significantly greater in alloxan diabetic rats. Voided urine volume per micturition contraction was also significantly higher in diabetic animals. However the post-voiding residual volume was not statistically different. Bethanechol potency (EC50 3µM versus 5µM) and maximal effect (31.2±5.9g/g versus 36.1±6.8g/g) in isolated bladder strips as well as number (169±4fmol/mg versus 176±3fmol/mg protein) and affinity (0.69±0.1nM versus 0.57±0.1nM) of bladder muscarinic receptors were also not statistically different.
CONCLUSION: Bladder function in vivo is altered in chronic alloxan-induced diabetes rats without changes in functional and biochemical characteristics of bladder muscarinic receptors.

INTRODUCTION

Following the initial description of six diabetic patients presenting with paralysis of the urinary bladder by Jordan et al.[1] accumulated evidence indicate that chronic diabetic patients frequently exhibit symptoms of urinary bladder dysfunction.[2] Diabetic bladder dysfunction symptoms, termed diabetic cystopathy when associated with peripheral neuropathy,[3] include micturition hyporeflexia, higher bladder capacity, urinary retention and even complete bladder atony.

The effects of chronic diabetes on urinary bladder function were studied in different animal models of diabetes. Although most studies showed an increase in bladder compliance and in the threshold volume required to elicit micturition contractions, conflicting results regarding the contractile function of the detrusor muscle and its nervous control in diabetic animals were described. For instance, cystometry (CMG) studies under isovolumetric conditions in 4 and 6 months diabetic Big Blue (BB) rats[4] showed an increase in threshold volume and amplitude of bladder contractions. In contrast, in 3 and 6 months alloxan-induced diabetes rats no differences were observed in the amplitude of bladder contractions under isovolumetric conditions.[5,6]Similarly, CMG studies under voiding conditions, in anesthetized 7-9-week-old streptozotocin (STZ) induced diabetes rats, showed no differences in the amplitude of micturition contractions.[7,8] However, in 8-11-week old STZ-induced diabetic rats, a voiding CMG study under non-anesthetized conditions showed that the amplitude of micturition contractions was greatly increased.[9] In contrast, in a recent study using 10- and 46-week-old Goto-Kakizaki diabetic rats, it was observed that the amplitude of micturition contractions was significantly diminished.[10]

Conflicting observations were also described regarding detrusor contractile response to nerve stimulation or to muscarinic agonists; for instance, detrusor contractions elicited by muscarinic agonists were reported as increased,[11-13] decreased[14] or unchanged in diabetic animals.[15]

OBJECTIVE

To re-examine the function of the urinary bladder in vivo as well as to determine the functional and biochemical characteristics of bladder muscarinic receptors in rats presenting long-term alloxan-induced diabetes.

METHODS

Experimental procedures were approved by the Animal Ethics Committee, of the Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Protocol #051/2011). All experiments were conducted at the Neurourology Laboratory of the Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

Diabetes was induced in 2-month old male Wistar rats by a single intravenous injection of alloxan (40mg/kg, diluted in 0.9% saline solution); two days after alloxan administration, non-fasted pooled blood samples were obtained from the tail for determination of whole blood glucose levels (glucose analyzer Beckman, Brea, California, United States). The animals with blood glucose levels ≥300mg/dL were considered diabetic and included in the study. Untreated age-paired rats were included as controls. Both groups of animals were kept for 11 months under similar housing conditions (room temperature 22±2°C, 12:12-hour light-dark cycle), with ad libitum access to food and water.

Eleven months after alloxan injection, non-fasted pooled blood samples were obtained from the tail from both groups to determine glucose levels in whole blood. Thereafter, control and diabetic animals were placed in metabolic cages to determine their 24-hour urinary output. The metabolic cages had a special net that allowed urine to pass separately from feces. After the metabolic cage study, four control and five diabetic rats were anaesthetized with sulfuric ether, had their ventral abdominal wall shaved and cleaned with betadine and their bladders exposed via a lower midline abdominal incision. One end of a polyethylene (PE-50) catheter with a flared tip to make a small collar was introduced in the bladder at the dome and secured with a ligature. The other end of the catheter was tunneled through the subcutaneous space and externalized at the lumbar region. Animals were then placed in special restraining cages designed to collect the urine voided with each micturition contraction. A continuous voiding CMG was performed after the rats had recovered completely from anesthesia. For this procedure an urinary catheter was connected via a three-way stopcock to a pressure transducer (World Precision Instruments Inc., Sarasota, United States) and to an infusion pump (KD Scientific Infusion Pump, Model 780.200, Series number 201755, United States). The pressure transducer was placed at the level of the pubic bone of the animal and saline solution (at room temperature) was continuously infused (flow rate 0.2mL/min) to elicit micturition contractions. Intravesical pressure (IVP) was continuously recorded in thermal paper using a multichannel polygraph (Narco BioSystems MK III, Houston, Texas, United States). After 20 to 30 minutes equilibrium period, a 30-minute CMG was recorded for analysis. The following parameters of the CMG were analyzed: maximal micturition pressure (IVP pressure developed during micturition contractions); micturition interval (time interval between return of IVP to baseline after a micturition contraction and the beginning of the next micturition contraction, that is, the time point at which the IVP showed a rapid increase); duration of micturition contractions, time lapsed from the beginning of the micturition contraction (see above) up to the return to baseline of the IVP. After recording the CMG for 30 minutes the infusion was stopped and the bladder was emptied. The infusion was then reinitiated and continued until the emission of urine accompanying the first micturition contraction started. The volume of voided urine was then measured and used to calculate the post-voiding residual volume using the formula: volume of infused saline minus the voided volume.

In vitro experiments

After the metabolic cage study, other four control and four diabetic rats were anaesthetized with sulfuric ether had their bladders exposed via a lower midline abdominal incision and removed. The bladders were placed in a Petri dish containing a modified Krebs solution (in mM: NaCl 119.4; NaHCO3 25.00; KCl 4.7; MgCl2 1.31; CaCl2 2.5; KH2PO4 1.17; glucose 11.1) and after removing adherent tissues longitudinal a strip (15-mm long x 3-mm wide) of the bladder wall was excised and mounted for recording of isometric contractions in a 10mL organ bath, containing the same Krebs solution kept at 37°C and continuously bubbled with 95% O2/5% CO2. The detrusor strip, under 1g basal tension, was allowed to stabilize for 60 minutes, changing the Krebs solution every 15 minutes. Following this equilibrium period, full cumulative concentration-response curves for the muscarinic agonist bethanechol were designed. After the experiment bladder strips were removed, blotted on filter paper and weighed. The weight of the strips was used to normalize the contractile force.

Biochemical determinations

After the metabolic cage study, six animals, three control and three diabetic, were anaesthetized with sulfuric ether, had their bladders removed, cut into small fragments and homogenized immediately in ice-cold HEPES Na+/Mg+, pH 7.4 (NaCl=100mM, MgCl2=10mM and HEPES=20mM) with a Brinkman Polytron set at speed 6 (twelve 5-second bursts at 15-second intervals). The homogenate was filtered through nylon mesh and centrifuged at 13.000rpm for 20 minutes. The supernatant fraction was discarded and the pellet was re-dissolved in HEPES buffer and diluted to a final protein concentration of 1.0mg/m. Protein concentration was determined by the method of Lowry et al.[16] using bovine serum albumin as standard. Duplicate samples of 0.5mL of the homogenate (corresponding to 0.5mg protein) were incubated at 32°C, in a Dubnoff shaker for 45 minutes, with several concentrations of [[3]H]-N-methyl-scopolamine ([[3]H]-NMS, 0.1 to 10nM) in the absence and presence of a 100 times excess of non-labeled scopolamine. Incubation was terminated by adding ice-cold HEPES buffer and rapid filtration under vacuum through GF/B glass fiber filters. Filters were rinsed twice with ice-cold HEPES buffer and transferred to scintillation vials containing 8mL of Aquasol (NEN, Boston Massachusetts, United States). After vigorous shaking, the filters were left for 24 hours in the dark to extract the radioactivity and counted in a Liquid Scintillation counter (Packard 1500, California, United States) for 2 minutes. Specific binding was defined as the difference of radioactivity in the presence and absence of scopolamine for each concentration of [[3]H]-NMS. Kd and Bmax of specific binding expressed per mg of protein was calculated using the linear regression plot of Scatchard.

Statistical analysis

All values of CMG parameters and of maximal tension of bladder strips are expressed as mean±SEM. The concentration of bethanechol required to cause contractions of a magnitude equal to 50% of the maximum (EC50) for each strip was calculated as the geometrical mean. Statistical significance of differences between control and diabetic rats was determined using the Student’s t test. A value of p<0.05 was considered as statistically significant.

RESULTS

Blood glucose levels in the alloxan-induced diabetes animals were significantly higher than in the control animals (p<0.05) (Table 1). Both groups of animals exhibited an increase in body weight during the 11-month period; however, alloxan-induced diabetes rats gained significantly less weight. Diabetic rats also showed significantly higher bladder weight and 24 hours urinary output (Table 1).

Table 1

Effect of the diabetes mellitus induced by alloxan on the body weight of the rat, bladder weight, blood glucose concentration and diuresis of 24 hours

	Control (n=8)	Diabetic (n=9)
Body weight, g
Initial g	150.0±5.0	160.0±20.0
Final g	520.0±30.8	330.0±10.0*
Bladder weight, mg	162.5±21.2	290.0±37.9*
Blood glucose, mg/dL	118.0±17.1	536.0±25.9*
Diuresis, mL/24hours	20.2±3.7	103.0±7.85*

*Statistically different from control (p<0.05).

Continuous voiding cystometrogram

In control animals continuous infusion of saline (0.2mL/min) caused periodical elevations of IVP associated with emission of urine. These elevations of IVP were considered micturition contractions. Maximal IVP during the micturition contraction was significantly greater in rats with alloxan-induced diabetes (34.6±4.7cmH2O versus 49.6±2.5cmH2O) (Figure 1A).

Figure 1

Values (mean±SEM) of intravesical pressure (A), interval (B), duration (C), micturition volume (D) and post-voiding residual volume (E) in non-anesthetized control and chronic diabetic rats.*p<0.05

The duration of micturition contractions (14.5±1.7 seconds versus 23.33±4.6 seconds) as well as the interval between micturition contractions (87.5±17.02 seconds versus 281.11±20.24 seconds) were significantly greater in the diabetic rats (Figures 1B and 1C). The voided urine volume with each contraction was also significantly greater in diabetic rats (1.60±0.1mL versus 0.52±0.1mL) (Figure 1D), whereas the calculated residual volume of both groups was not significantly different (0.08±0.05mL versus 0.14±0.06mL) (Figure 1E).

In isolated bladder strips from both control and diabetic animals, bethanechol (0.1 to 100µM) caused concentration-dependent contractions with similar potency (EC50 3µM versus 5µM) and maximal effect (31.2±5.9g/g versus 36.1±6.8g/g) (Figure 2).

Figure 2

Concentration-effect curves for bethanechol in isolated bladder strips from control (n=4) and alloxan-induced diabetes rats (n=4)

In addition, no differences were found in the total number (169±4fmol/mg protein versus 176±3fmol/mg protein) or affinity (0.69±0.1nM versus 0.57±0.1nM) of the specific [[3]H]-NMS binding sites present in bladder homogenates from both diabetic and control animals (Figure 3).

Figure 3

Scatchard plot analysis of specific [3H]-NMS binding sites in rat bladder homogenates control (O, n=3) and diabetic (●, n=3) rats

DISCUSSION

The present study was conceived to re-examine urinary bladder function and muscarinic receptor functional and biochemical characteristics in alloxan-induced diabetes rats, kept with no treatment for a long period of time (11 months) to mimic human chronic diabetes. Alloxan-induced diabetes rats showed increased urinary output and urinary bladder weight which is consistent with similar observations found in several animal models of diabetes mellitus.[5,6,12-15,17,18] Previous studies in alloxan-induced diabetes rats evaluated bladder function in anesthetized animals under non-voiding (isovolumetric) conditions after 4 or 6 months of alloxan administration. Considering that such conditions are rather non-physiological, one of the aims of the present study was to explore bladder function in awaken animals and under voiding conditions which are more relevant physiologically. The main cystometric findings of the present study include higher maximal IVP and duration of micturition contractions, as well as higher micturition contraction interval in diabetic rats; no differences were observed in residual volume between control and diabetic animals. In addition, and in contrast with what was observed in voiding CMG of non-anesthetized chronic STZ-induced diabetes rats,[9] during the filling phase of CMG, no IVP variations (non-voiding contractions) were observed between micturition contractions in alloxan-induced diabetes rats for 11 months. The observation that alloxan-induced diabetes rats exhibited significant elevation of maximal micturition pressure during a conscious voiding CMG is, to the best of our knowledge, original and it was not observed in a previous study, in which voiding CMG was performed in non-anesthetized STZ-induced diabetes animals, for 6 months;[17] in addition, no differences were observed in maximal IVP in voiding CMG in anesthetized STZ-induced diabetes rats for 2 months.[7,8]However, conscious voiding CMG studies in rats with STZ-induced diabetes showed an increase in maximal IVP in earlier stages of diabetes (6 to 9 weeks).[9,17,18] It is worth noting that the latter study[18] showed that in 12 and 20 weeks diabetic rats, the maximal IVP was significantly decreased. These authors proposed that urinary bladder function in chronic diabetic animal models undergo a transition from a compensated (early stages of diabetes mellitus), to a decompensated state. This appears not to be the case in alloxan-induced diabetes rats, since the present study showed that after 11 months of diabetes the maximal IVP was still significantly higher in the diabetic animals. Although the increased micturition pressure observed in conscious voiding CMG studies of STZ-induced diabetes rats for 8 to 9 weeks[9,18] could be attributed to an increase in detrusor muscle sensitivity to acetylcholine.[12] This explanation does not apply to the results of the present study, since no differences were observed in the potency or maximal effect of bethanechol to cause contractions of isolated detrusor strips. Consistent with the present observations, previous studies in chronic (5 weeks or 3 months) alloxan-induced diabetes rats showed no differences in detrusor contractions elicited by bethanechol or nerve stimulation.[6,15] Furthermore, in chronic STZ-induced or BB diabetic rats detrusor responses to cholinergic agonists or nerve stimulation were found to be significantly diminished[7,13,14] or unchanged.[13,17] Although an increase in the total number of receptors in bladder domes of 2- and 4-week STZ-induced diabetes rats has been described;[12] in the present study no differences were observed in the affinity or total number of specific [[3]H]-NMS binding sites in bladder homogenates between control and alloxan-induced diabetes rats. It is worth noting that since in our study the specific binding of NMS was corrected by the protein content of the homogenates our findings are consistent with the data presented by Latifpour et al.[12] when corrected in the same manner. Thus, the elevated maximal micturition IVP observed in the diabetic animals is most likely the result of the bladder hypertrophy present in these animals.

The fact that the micturition contraction interval was increased in diabetic rats is an indication that the threshold volume required to trigger the micturition reflex was also increased. Indeed, considering the infusion flow and the micturition interval the estimated threshold volume increased from 0.29mL in the controls animals to 0.94mL in the diabetic animals. This difference is an indication of a sensory bladder déficit in long-term alloxan-induced diabetes rats and is entirely consistent with previous observations[7,8,18] and most likely related to A-delta and C fibers abnormalities described in diabetic animals.[16,19]

CONCLUSION

This study showed for the first time that micturition contractions during voiding cystometry in conscious long-term (11 months) alloxan-induced diabetes rats had higher amplitude and duration, which could be attributed to changes in the functional or biochemical characteristics of bladder muscarinic receptors. It showed, in addition, that the interval between micturition contractions was greatly increased in alloxan-induced diabetes rats indicating a sensory déficit most likely related to bladder afferent sensory-motor fiber neuropathy.

INTRODUÇÃO

Após o relato inicial de Jordan et al.[1] de seis pacientes diabéticos que apresentavam paralisia da bexiga, as evidências acumuladas indicam que os pacientes diabéticos crônicos frequentemente apresentam sintomas de disfunção da bexiga.[2] Os sintomas de disfunção diabética da bexiga, denominada cistopatia diabética, quando associada a neuropatia periférica,[3] incluem hiporreflexia miccional, aumento da capacidade vesical, retenção urinária e até completa atonia vesical.

Os efeitos do diabetes crônico sobre o funcionamento da bexiga foram estudados em diversos modelos animais de diabetes. Embora a maioria dos estudos tenha mostrado aumento da complacência vesical e do volume limiar necessário para provocar contrações miccionais, foram descritos resultados conflitantes no tocante à função contrátil do músculo detrusor e seu controle nervoso em animais diabéticos. Estudos com cistometria (CMG) sob condições isovolumétricas em ratos Big Blue (BB) diabéticos de 4 e 6 meses,[4] por exemplo, mostraram aumento no limiar de volume e na amplitude das contrações vesicais. Por outro lado, em ratos de 3 e 6 meses com diabetes induzido por aloxana não foram observadas diferenças na amplitude das contrações da bexiga sob condições isovolumétricas.[5,6] De modo semelhante, estudos de CMG em condições miccionais, realizados em ratos anestesiados de 7 a 9 semanas com diabetes induzido por estreptozotocina (STZ), não apresentaram diferenças na amplitude das contrações miccionais.[7,8] No entanto, um estudo de CMG em condições miccionais realizado em ratos com diabetes induzido por STZ de 8 a 11 semanas não anestesiados mostrou que a amplitude das contrações miccionais tinha aumentado muito.[9] Por outro lado, em um estudo recente realizado em ratos diabéticos Goto-Kakizaki de 10 e 46 semanas, observou-se que a amplitude das contrações miccionais diminuiu significativamente.[10]

Também foram descritas observações conflitantes em relação à resposta contrátil do detrusor à estimulação nervosa ou a agonistas muscarínicos; por exemplo, as contrações do músculo detrusor induzidas por agonistas muscarínicos em animais diabéticos foram descritas como aumentadas,[11-13] diminuídas[14] ou inalteradas.[15]

OBJETIVO

Reestudar o funcionamento da bexiga in vivo e determinar as características funcionais e bioquímicas dos receptores muscarínicos vesicais em ratos com diabetes de longo prazo induzido por aloxana.

MÉTODOS

Os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (Protocolo no 051/2011.) Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Neuro-Urologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

Foi induzido diabetes em ratos machos Wistar de 2 meses por meio de uma única injeção intravenosa de aloxana (40mg/kg, diluído em solução fisiológica a 0,9%); 2 dias após a administração de aloxana, na ausência de jejum, foram colhidas amostras sanguíneas da cauda para determinação da glicemia em sangue total (glicosímetro Beckman, Brea, Califórnia, Estados Unidos). Os animais com glicemia ≥300mg/dL foram considerados diabéticos e incluídos no estudo. Ratos não tratados pareados por idade foram incluídos como controle. Ambos os grupos de animais foram mantidos por 11 meses em condições similares de alojamento (temperatura ambiente de 22±2°C, ciclo claro-escuro de 12/12 horas), com acesso ad libitum a água e comida.

Onze meses após a injeção de aloxana, na ausência de jejum, foram colhidas amostras sanguíneas da cauda de ambos os grupos, para determinação da glicemia em sangue total. Em seguida, os animais controle e diabéticos foram colocados em gaiolas metabólicas para determinar o débito urinário de 24 horas. As gaiolas metabólicas tinham uma rede especial que permitia que a urina fosse separada das fezes. Após o estudo na gaiola metabólica, quatro ratos controle e cinco ratos diabéticos foram anestesiados com éter sulfúrico, submetidos a tricotomia da parede abdominal ventral e antissepsia com betadine, com exposição da bexiga via incisão abdominal na linha média inferior. Uma das pontas do cateter de polietileno (PE-50) foi submetida a uma temperatura elevada para formar um pequeno colar; esse cateter foi implantado no ápice da bexiga e fixado com uma sutura. A outra ponta do cateter foi tunelizada por via subcutânea e exteriorizada na região lombar do animal. Após o procedimento, o cateter foi conectado a uma torneira de três vias, que estava conectada a um transdutor de pressão, posicionado no nível da sínfise púbica do animal. A solução fisiológica de salina foi infundida. Em seguida, o animal foi colocado em uma gaiola especial de contenção para coletar urina eliminada a cada contração miccional. CMG miccional contínua foi realizada após os ratos se recuperarem completamente da anestesia. Para esse procedimento, um cateter vesical foi conectado por meio de uma torneira de três vias a um transdutor de pressão (World Precision Instruments Inc., Sarasota, Estados Unidos) e a uma bomba de infusão (Bomba de Infusão KD Scientific, Modelo 780.200, número de série 201755, Estados Unidos). O transdutor de pressão foi posicionado ao nível do osso púbico do animal, infundindo-se solução salina (em temperatura ambiente) de modo contínuo (velocidade de infusão 0,2mL/min) para induzir as contrações miccionais. A pressão intravesical (PIV) foi registrada continuamente em papel térmico utilizando-se um polígrafo multicanal (Narco BioSystems MK III, Houston, Texas, Estados Unidos). Após um período de equilíbrio de 20 a 30 minutos, uma CMG de 30 minutos foi registrada para análise. Foram analisados os seguintes parâmetros da CMG: a pressão miccional máxima (PIV desenvolvida durante as contrações miccionais); intervalo entre as micções (intervalo de tempo entre o retorno da PIV ao valor inicial, após uma contração miccional e o início da contração miccional seguinte, ou seja, o ponto no tempo em que a PIV apresentou uma rápida elevação); e duração das contrações miccionais, tempo decorrido desde o início da contração miccional (ver acima) até o retorno da PIV à linha de base. Após registrar a CMG por 30 minutos, a infusão foi interrompida, e a bexiga, esvaziada. A infusão foi, então, reiniciada, prosseguindo até o início da emissão de urina que acompanhava a primeira contração miccional. O volume de urina eliminado foi, então, medido e usado para calcular o volume residual pós-miccional por meio da seguinte fórmula: volume de solução salina infundido menos volume eliminado.

Experimentos in vitro

Após o estudo na gaiola metabólica, outros quatro ratos controle e quatro ratos diabéticos foram anestesiados com éter sulfúrico e submetidos à exposição e remoção da bexiga por meio de incisão abdominal na linha média inferior. As bexigas foram colocadas numa placa de Petri contendo uma solução de Krebs modificada (em mM: NaCl 119,4; NaHCO3 25,00; KCl 4,7; MgCl2 1,31; CaCl2 2,5; KH2PO4 1,17; glicose 11,1) e, após remoção dos tecidos aderentes longitudinais, uma tira de bexiga (15mm de comprimento x 3mm de largura) foi montada para registro das contrações isométricas num banho de órgãos de 10mL, contendo a mesma solução de Krebs mantida a 37°C e continuamente borbulhada com O2 a 95%/CO2 a 5%. A tira de músculo detrusor, sob tensão basal de 1g, foi deixada para estabilizar por 60 minutos, com troca da solução de Krebs a cada 15 minutos. Após esse período de equilíbrio, foram preparadas curvas concentração-resposta cumulativa para o agonista muscarínico betanecol. Depois do experimento, as tiras de bexiga foram removidas, secas em papel filtro e pesadas. O peso das tiras foi usado para normalizar a força contrátil.

Determinações bioquímicas

Depois do estudo na gaiola metabólica, seis animais, três controle e três diabéticos, foram anestesiados com éter sulfúrico, sendo removida a bexiga deles, que foi cortada em pequenos fragmentos e imediatamente homogeneizada em HEPES Na+/Mg+ gelado, pH 7,4 (NaCl=100mM, MgCl2=10mM e HEPES=20mM) utilizando-se um homogeneizador Brinkman Polytron em velocidade 6 (12 impulsos de 5 segundos a intervalos de 15 segundos). O homogenato foi filtrado em malha de nylon e centrifugado a 13.000rpm por 20 minutos. A fração do sobrenadante foi descartada e o pellet foi novamente dissolvido em tampão HEPES e diluído a uma concentração proteica final de 1,0mg/m. A concentração proteica foi determinada pelo método de Lowry et al.,[16] usando albumina de soro bovino como padrão. Amostras duplicadas de 0,5mL do homogenato (correspondentes a 0,5mg de proteína) foram incubadas a 32°C em agitador Dubnoff por 45 minutos, com diversas concentrações de [[3]H]-N-metil-escopolamina ([[3]H]-NMS, 0,1 a 10nM) na ausência e na presença de um excesso de cem vezes de escopolamina não marcada. A incubação foi encerrada pela adição de tampão de HEPES gelado e filtração rápida sob vácuo por meio de filtros de fibra de vidro GF/B. Os filtros foram enxaguados duas vezes com tampão HEPES gelado e transferidos para frascos de cintilação contendo 8mL de Aquasol (NEN, Boston, Massachusetts, Estados Unidos). Após vigorosa agitação, os filtros foram deixados por 24 horas no escuro para extrair a radioatividade e contados num contador de cintilação em meio líquido (Packard 1500, Califórnia, Estados Unidos) por 2 minutos. A ligação específica foi definida como a diferença de radioatividade na presença e na ausência de escopolamina para cada concentração de [. Foram calculados os valores de Kd e Bmax da ligação específica, expressos em mg de proteína, usando-se o método de regressão linear de Scatchard.

Análise estatística

Todos os valores dos parâmetros da CMG e da tensão máxima das tiras de bexiga foram expressos como média±SEM. A concentração do betanecol necessária para causar contrações de magnitude igual a 50% da máxima (EC50) para cada tira foi calculada como a média geométrica. A significância estatística das diferenças entre os ratos controle e os diabéticos foi determinada usando-se o teste t de Student. Um valor de p<0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

RESULTADOS

Os níveis de glicemia nos animais com diabetes induzido por aloxana foram significativamente maiores do que nos animais controle (p<0,05) (Tabela 1). Ambos os grupos de animais apresentaram aumento no peso corpóreo durante o período de 11 meses. No entanto, os ratos com diabetes induzido por aloxana ganharam significativamente menos peso. Os ratos diabéticos também apresentaram peso da bexiga e débito urinário de 24 horas significativamente maiores (Tabela 1).

Tabela 1

Efeito do diabetes mellitus induzido por aloxana no peso corpóreo do rato, peso da bexiga, concentração de glicose no sangue e diurese de 24 horas

	Controles (n=8)	Diabéticos (n=9)
Peso corporal, g
Inicial	150,0±5,0	160,0±20,0
Final	520,0±30,8	330,0±10,0*
Peso da bexiga, mg	162,5±21,2	290,0±37,9*
Glicemia, mg/dL	118,0±17,1	536,0±25,9*
Diurese, mL/24 horas	20,2±3,7	103,0±7,85*

*Estatisticamente diferente do controle (p<0,05).

Cistometria miccional contínua

Nos animais controle, a infusão contínua de solução salina (0,2mL/min) causou elevações periódicas da PIV associadas à emissão de urina. Elevações da PIV foram consideradas contrações miccionais. A PIV máxima durante a contração miccional foi significativamente maior nos ratos com diabetes induzido por aloxana (34,6±4,7cmH2O versus 49,6±2,5cmH2O) (Figura 1A).

Figura 1

Valores (média±SEM) da pressão intravesical (A), intervalo (B), duração (C), volume de micção (D) e volume residual pós-miccional (E) em ratos não anestesiados (ratos controle e diabéticos). *p<0,05

A duração das contrações miccionais (14,5±1,7 segundos versus 23,33±4,6 segundos) bem como o intervalo entre as contrações miccionais (87,5±17,02 segundos versus 281,11±20,24 segundos) foram significativamente maiores nos ratos diabéticos (Figuras 1B e 1C). O volume urinário eliminado a cada contração também foi significativamente maior nos ratos diabéticos (1,60±0,1mL versus 0,52±0,1mL) (Figura 1D), embora o volume residual calculado de ambos os grupos não tenha sido significativamente diferente (0,08±0,05mL versus 0,14±0,06mL) (Figura 1E).

Nas tiras de bexiga isoladas tanto de animais controle quanto diabéticos, o betanecol (0,1 a 100µM) causou contrações dependentes de concentração com potência (EC50 3µM versus 5µM) e efeito máximo (31,2±5,9g/g versus 36,1±6,8g/g) semelhantes (Figura 2).

Figura 2

Curvas de concentração-resposta para o betanecol em tiras de bexiga isoladas de ratos controle (n=4) e ratos com diabetes induzido por aloxana (n=4)

Além disso, não foram observadas diferenças no número total (169±4fmol/mg de proteína versus 176±3fmol/mg de proteína) ou na afinidade (0,69±0,1nM versus 0,57±0,1nM) dos sítios de ligação específica da [[3]H]-NMS nos homogenatos, tanto de animais controle quanto nos diabéticos (Figura 3).

Figura 3

A análise de Scatchard de sítios de ligação específica do [3H]-NMS em homogenatos de bexiga de ratos controle (O, n=3) e diabéticos (●, n=3)

DISCUSSÃO

O presente estudo foi concebido para rever as funções vesicais e as características funcionais e bioquímicas dos receptores muscarínicos em ratos com diabetes induzido por aloxana, mantidos sem tratamento por um longo período de tempo (11 meses), de modo a mimetizar o diabetes crônico humano. Os ratos com diabetes induzido por aloxana apresentaram maior débito urinário e peso da bexiga, de modo condizente com observações semelhantes encontradas em vários modelos animais de diabetes mellitus.[5,6,12-15,17,18] Estudos anteriores com ratos com diabetes induzido por aloxana avaliaram a função vesical em animais anestesiados sob condições não miccionais (isovolumétricas), após a administração de aloxana por 4 ou 6 meses. Considerando que essas condições não são fisiológicas, um dos objetivos do presente estudo foi estudar a função vesical em animais despertos e sob condições miccionais mais relevantes em termos fisiológicos. Os principais achados cistométricos do presente estudo incluem maior PIV máxima e duração das contrações miccionais, bem como maior intervalo de contração miccional nos ratos diabéticos; nenhuma diferença foi observada no volume residual, comparando-se os ratos do grupo controle com o dos animais diabéticos. Além disso, ao contrário do que foi observado em CMG miccional de ratos com diabetes crônico induzido por STZ,[9] durante a fase de enchimento da CMG, não foram observadas variações da PIV entre as contrações miccionais nos ratos com diabetes induzidos por aloxana por 11 meses. A observação de que os ratos com diabetes induzido por aloxana apresentaram uma elevação significativa da pressão máxima de micção durante uma CMG miccional consciente é, pelo que se sabe, inédita e não observada em um estudo prévio, em que a CMG miccional tenha sido realizada em animais com diabetes induzido por STZ, por 6 meses.[17] Além disso, nenhuma diferença foi observada na PIV máxima na CMG miccional em ratos anestesiados com diabetes induzido por STZ por 2 meses.[7,8] Contudo, os estudos de CMG miccionais em ratos conscientes com diabetes induzido por STZ mostraram um aumento na PIV máxima nos estágios iniciais do diabetes (6 a 9 semanas).[9,17,18] É importante salientar que esse último estudo[18] mostrou que em ratos diabéticos de 12 e 20 semanas, a PIV máxima estava significativamente diminuída. Esses autores propuseram que a função da bexiga nos modelos animais de diabetes crônico passa por uma transição de um estado compensado (estágios iniciais do diabetesmellitus) para um estado descompensado. Esse não parece ser o caso nos ratos com diabetes induzido por aloxana, uma vez que o presente estudo mostrou que, após 11 meses de diabetes, a PIV máxima ainda era significativamente mais elevada nos animais diabéticos, embora a pressão miccional aumentada observada nos estudos de CMG miccionais conscientes em ratos com diabetes induzido por STZ por 8 a 9 semanas[9,18] pudesse ser atribuída a uma sensibilidade aumentada do músculo detrusor à acetilcolina.[12] Essa explicação não se aplica aos resultados do presente estudo, uma vez que não foram observadas diferenças na potência ou no efeito máximo do betanecol em causar contrações em tiras isoladas de músculo detrusor. De modo condizente com essas observações, estudos anteriores realizados em ratos com diabetes crônico (5 semanas ou 3 meses) induzido por aloxana não mostraram diferença nas contrações do músculo detrusor induzidas por betanecol ou estimulação nervosa.[6,15] Além disso, em ratos com diabetes crônico induzido por STZ ou em ratos BB diabéticos, verificou-se que as respostas do músculo detrusor a agonistas colinérgicos ou a estimulação nervosa estavam significativamente diminuídas[7,13,14] ou inalteradas.[13,17] Embora tenha sido descrito um aumento no número total de receptores do ápice da bexiga de ratos de 2 e 4 semanas com diabetes induzido por STZ,[12] no presente estudo não foram observadas diferenças na afinidade ou no número total de sítios específicos de ligação [[3]H]-NMS nos homogenatos de bexiga, ao compararmos os ratos controle com os ratos com diabetes induzido por aloxana. Vale notar que como em nosso estudo a ligação específica de NMS foi corrigida pelo conteúdo proteico dos homogenatos, nossos achados são consistentes com os dados apresentados por Latifpour et al.,[12] quando corrigidos do mesmo modo. Portanto, a PIV miccional máxima elevada observada nos animais diabéticos é muito provavelmente decorrente da hipertrofia da bexiga presente nesses animais.

O fato de o intervalo entre as contrações miccionais estar elevado nos ratos diabéticos é indicativo de que o limiar de volume exigido para desencadear o reflexo miccional também estivesse aumentado. De fato, considerando o fluxo de infusão e o intervalo miccional, o limiar de volume estimado aumentou de 0,29mL nos animais controle para 0,94mL nos animais diabéticos. Essa diferença indica um déficit sensitivo vesical nos ratos com diabetes de longo prazo induzido por aloxana, sendo bem condizente com observações prévias[7,8,18] e muito provavelmente estando relacionada a anormalidades nas fibras A-delta e C descritas nos animais diabéticos.[16,19]

CONCLUSÃO

Este estudo mostrou pela primeira vez que as contrações miccionais durante a cistometria em ratos conscientes com diabetes de longo prazo (11 meses) induzido por aloxana tiveram maior amplitude e duração, que não puderam ser atribuídas a mudanças nas características funcionais ou bioquímicas dos receptores muscarínicos da bexiga. Ele mostrou, além disso, que o intervalo entre as contrações miccionais estava muito aumentado nos ratos com diabetes induzido por aloxana, indicando déficit sensitivo muito provavelmente relacionado à neuropatia de fibras sensitivo-motoras aferentes da bexiga.