Long-lasting endothelium-dependent relaxation of isolated arteries caused by an extract from the bark of Combretum leprosum.

OBJECTIVE: To describe and to characterize the relaxing effect of an extract of the bark of Combretum leprosum on isolated arterial rings from different animals.
METHODS: Rings (3 to 4mm) from rabbit, rat, or porcine arteries rings were suspended in an organ bath (Krebs, 37°C, 95%O2/5%CO2) to record isometric contractions. After the stabilization period (2 to 3 hours) contractions were induced by the addition of phenylephrine (0.1 to 0.3µM) or U46619 (10 to 100nM), and Combretum leprosum extract was added on the plateau of the contractions. Experiments were performed to determine the potency, duration, reversibility, and to get insights on the potential mechanism involved in extract-induced relaxations.
RESULTS: In all rings tested, Combretumleprosum extract (1.5μg/mL) was able to cause relaxations, which were strictly endothelium-dependent. In rabbit or rat thoracic aorta rings, the relaxations were reversed by vitamin B12a or L-NG-nitroarginine. In porcine right coronary arteries and rabbit abdominal aorta, extract caused both L-NG-nitroarginine-sensitive and L-NG-nitroarginine-resistant relaxations. In rabbit thoracic aorta, the extract was relatively potent (EC50=0.20µg/mL) and caused relaxations; intriguingly the endothelium continued to produce relaxing factors for a long period after removing the extract. The magnitude of extract-induced relaxations was significantly reduced in the absence of extracellular Ca2+; in addition, the TRPs channels blocker ruthenium red (10µM) was able to revert extract-induced relaxations. Phytochemical analyses indicated that the extract was rich in polyphenol-like reacting substances.
CONCLUSIONS: Combretum leprosum extract contains bioactive compounds capable of promoting Ca2+-dependent stimulation of endothelial cells which results in a prolonged production of relaxing factors.

INTRODUCTION

Combretum leprosum Mart. (Combretaceae) is a shrub or small tree that grows in northeastern Brazil where it is known as mufumbo, mofumbo, cipoaba and pente-de-macaco. In folk medicine, extracts from different parts of the plant are being used for alleged expectorant, hemostatic, sedative, and aphrodisiac properties.[1,2]

In a bioactivity-based screening of the potential effects of the lyophilized hydroalcoholic extract of Combretum leprosum (ECL) bark on visceral and vascular smooth muscles, it was observed that the extract caused a potent endothelium-dependent relaxation (EDR) of rabbit thoracic aorta rings. Although some substances isolated from related species of the Combretum genus have been shown to cause EDR in rat aorta (mollic acid glucoside, isolated from Combretum molle) as well as methanolic fractions rich in flavonoids from Combretum celastroides and Combretum racemosum, [3,4] all previously reported effects of flower, leaf and/or root ECL did not include any cardiovascular bioactivity.

Endothelial cells exhibit remarkable heterogeneity in responsiveness to agents that induce EDR either of homologous arteries from different animals species or of arteries from different vascular beds from the same animal; e.g acetylcholine (ACh), but not bradykinin (BK), induces EDR in the rabbit and rat aorta;[5,6] similarly, histamine causes EDR in rat aorta but not in rabbit aorta. Therefore, it is highly recommended when describing the EDR of a new drug or natural product to examine its effects in same artery from more than one animal species and in different arteries from the same animal.

OBJECTIVE

To describe and interpret the results of experiments conceived to answer the following questions regarding the observed novel effect of extract of Combretum leprosum: (1) Which is the site of action, the potency, and the duration of the effect of the extract of Combretum leprosum in provoking relaxations of the rabbit thoracic aorta rings? (2) Is the extract of Combretum leprosum capable of causing endothelium-dependent relaxation in isolated arterial rings from other vessels of the rabbit or from vessels of rat, mice, guinea-pig and pig? (3) Which are the possible mechanisms involved in the extract of Combretum leprosum-induced relaxations of rabbit thoracic aorta rings?

METHODS

Plant material

The stem bark of C. leprosum was collected in the morning (10 to 11:00am) on July 15, 2005, at the Agrarian Science Center, Universidade Federal do Piauí, Teresina (PI), Brazil. A voucher specimen (number 10,557) was deposited in the Graziela Barroso Herbarium (TEPB, at the same institution). The plant material was dried in the shade at 40±1°C, and the stem bark powder (500g) was extracted (three times) with 1L of 70% ethanol, evaporated in a vacuum at 50°C and lyophilized to obtain a dry extract, which was stored under refrigeration (4°C) until further use. The extract was freshly diluted in distilled water for experiments.

Isolated organ experiments

Thirty male and female New Zealand rabbits (2.5 to 3.5kg) and 20 Wistar rats (200 to 250g), 5 male guinea-pigs (350g), and 10 male mice (24 to 30g) were employed for all the experiments. The animals were obtained from the vivarium of the Ribeirão Preto Campus of the Universidade de São Paulo. Hearts from ten pigs were obtained from a local slaughterhouse; they were removed immediately after the death of the animal, washed with cold Krebs solution to remove most of the blood, and transported to the laboratory in sealed plastic bags in a cooler box containing crushed ice. Within 2 to 3 hours after heart removal from the animals, the right and/or left coronary arteries were dissected out for preparation of the arterial rings. All experimental protocols were in accordance with the ethical principles for animal experimentation recommended by the Colégio Brasileirode Experimentação Animal [Brazilian College of Animal Experimentation] and were approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (number 084/2011) of Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto of Universidade de São Paulo.

Rats, mice, guinea-pigs, and rabbits were euthanized under sodium pentobarbital anesthesia (50mg/kg i.p. for rats, mice, and guinea-pigs and/or by marginal ear vein injection for rabbits). The thoracic descending aorta (from all animals) as well as the abdominal aorta, the superior mesenteric artery, and the common carotid artery (from rabbits) were quickly removed and placed in Krebs solution (116mM of sodium chloride − NaCl; 4.5nM potassium chloride - KCl; 1.14mM of monobasic sodium phosphate − NaH2PO4; 1.16nM of magnesium chloride − MgCl2; 2.5nM of Calcium chloride − CaCl2; 25nM od Sodium bicarbonate − NaHCO3; and 11.1 of D-glucose) containing diclofenac (10µM) to inhibit synthesis of cyclooxygenase derived-products.[6] After all adherent tissues were removed, the arteries were cut into rings (3 to 4mm) taking care to preserve the endothelium; when required, the intima of some rings was rubbed with a metal stick to destroy the endothelium. The rings were suspended between thin metal brackets and mounted under an initial tension of 2 to 4g in isolated organ chambers (volume: 5 to 10mL) containing Krebs solution at 37±1°C bubbling continuously with 5% of carbon dioxide (CO2) and 95% of oxygen (O2). The isometric tension of each ring was continuously recorded and stored using the data acquisition system Lab Chart software.

Experimental protocols

To test the viability of the rings, submaximal concentrations of phenylephrine (PE; 0.1 to 1μmol/L) or U46619 (10 to 30nmol/L) were added twice at hourly intervals. During the contraction plateau induced by the second addition of PE (or U46619), the functional integrity of the endothelium was tested by addition of ACh (1μmol/L) or BK (0.1μmol/L, pig coronary artery). Those rings in which ACh (or BK) caused a decrease of at least 80% of PE (or U46619)-induced tension were considered as containing intact functional endothelium. One hour after determining endothelium functionality, PE (or U46619) was again added to contract the rings and at the plateau of the contraction, and a supramaximal concentration of ECL (1.5μg/mL) was added.

To determine whether nitric oxide (NO) synthesis and/or release were required for ECL-induced relaxations, L-NG-nitro-L-arginine (L-NNA, 300μmol/L) or hydroxocobalamin (B12a; 30 to 100μM) were added when the relaxation response induced by ECL attained a steady state. To determine whether ECL-induced relaxations required the presence of extracellular Ca[2], the effect of ECL was tested in preparations incubated in Krebs solution containing nominally zero Ca[2]. To determine whether Ca[2] influx into endothelial cells was involved in ECL-induced relaxations, the effect of the addition of ruthenium red (RR; 10μmol/L, a non-selective blocker of Ca[2] permeable channels) when the relaxation response induced by ECL attained a steady state was also examined.

The potency of ECL was calculated from concentration-effect curves obtained in a non-cumulative manner using intact endothelium rings from rabbit thoracic aortas, i.e. by adding single concentrations of ECL (0.1, 0.3, and 1.0µg/mL) on the plateau of PE-induced contractions at 45 to 60 minutes intervals. All drugs and the extract solutions were added in the medium chamber through a pipette in a volume of 1 to 30µL.

Measurements of polyphenols

To estimate the total phenolic OH groups, the Folin-Ciocalteu (FC) method was utilized.[7] The ECL (0.5mg/mL) solutions were diluted in aqueous sodium hydroxide (NaOH; 1%) to produce solutions with following concentrations: 1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10, and 12.5µg/mL. To these solutions, 500µL of FC reagent were added followed by vigorous shaking for 2 minutes. Later, 500µL of sodium carbonate (Na2CO3; 75g/mL) were added and these solutions were incubated at room temperature or at 50°C, for 20 minutes. Incubations were ended by cooling the solutions in ice water bath for 5 minutes. The specific absorbance at 700nm was determined using an Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) plate reader; determinations were performed in triplicate. Solutions of gallic acid (GA) and quercetin (dissolved in 10% aqueous methanol) were utilized as standard polyphenol compounds.

Statistical analyses

The ECL-induced relaxations of arterial rings were expressed as percentage of reduction (% tension) of the tension developed by PE- or U46619-induced contractions; the reversion of these relaxations by inhibitors was expressed as percentage of the relaxation magnitude (% relaxation). Values are presented as mean ± standard error of the mean (SEM). The ECL concentration causing half-maximal relaxation (EC50) was determined by fitting the original concentration-response curve to a sigmoidal curve using GraphPad Prism® Software, version 5.0. Values (in percentage) of changes in the tonus were analyzed by the t Student test (two-tailed), paired (in the same arterial ring) or unpaired (in the different arterial rings). Values of p<0.05 were considered statistically significant.

Chemicals

ACh, BK, FC reagent, GA, B12a, PE, quercetin, reagent grade ethanol, RR, and U46619 were obtained from Sigma (United States). Diclofenac was obtained from Calbiochem™ (United States). L-NNA was obtained from Research Biochemicals International (United States).

RESULTS

Initial experiments using rings from rabbit thoracic aorta with intact endothelium showed that an aqueous suspension of ECL at the concentration of 1.0 to 1.5µg/mL caused relaxations of magnitude similar to or even greater than those caused by ACh (1µM) (Figure 1A). While relaxations elicited by ACh were initiated almost immediately after its addition, those elicited by ECL required between 60 to 90 seconds to become apparent; furthermore while the relaxing effect of ACh reached a plateau in about 2 minutes, ECL induced effects took about 10 minutes to reach the plateau. The maximal velocity of relaxations, measured from the first derivative equation (dT/dt) were -90.33±5.41mg/s (n=8) and -39.83±2.28mg/s (n=8) for ACh (1µM) and ECL (1.0µg/mL), respectively (Figure 1B).

Figure 1

Representative tracings showing the effect of acetylcholine (ACh; 1µM) and extract of Combretum leprosum (ECL; 1.0µg/mL) on the isometric tension developed by rings of rabbit thoracic aorta pre-constricted with Phenylephrine (PE; 100nM) (A). The first derivative (dT/ dt, mg/s) of relaxing effects induced by ECL (1.0µg/mL) and ACh (1µM) (B). The effect of ECL (1.5µg/mL) on the isometric tension developed by rings, with (+E) or without (-E) endothelium, of rabbit thoracic aorta (C), rat thoracic aorta (D) pre-constricted with phenylephrine (PE), and porcine right coronary artery pre-constricted with U46619 (E). In (F), mean ± standard error of the mean (SEM) values of the magnitude of the relaxations observed in 4-20 similar experiments (relaxation magnitude is expressed as a percentage of reduction of PE- or U46619-induced contraction). ***Two-tailed p<0.0001 (unpaired t-test). W: washout of the preparation for 60-45 minutes

ECL-induced relaxation could be due to a direct action on the smooth muscle cells or to an indirect action mediated by the endothelium as is now well established for ACh and other agents.[5] To distinguish between these alternatives, the effect of ECL was determined in rabbit thoracic aorta rings containing endothelium or in rings in which the endothelium had been removed, as can be observed in figure 1C. ECL did not cause relaxations in rings without endothelium.

In order to determine whether ECL caused EDR in other arteries from the rabbit or in arteries from other animal species, the effect of ECL was determined in rings from rabbit abdominal aorta, rabbit superior mesenteric artery, rabbit common carotid artery, rat thoracic aorta, guinea-pig thoracic aorta, mouse thoracic aorta, and porcine coronary arteries. As shown in figure 1D and 1E, ECL at 1.5µg/mL caused relaxations which were also strictly endothelium-dependent in rat thoracic aorta and in porcine right coronary artery rings. Similar findings were observed in all the other arteries tested.

In rabbit and rat thoracic aorta, EDR are entirely mediated by NO; thus, the effect of a nitric oxide synthase (NOS) inhibitor (L-NNA) and of a NO scavenger (B12a) upon ECL- induced EDR was examined. As shown in figures 2A, 2B, 2C, 2D, and 2E the addition of L-NNA or B12a on the plateau of ECL-induced relaxations of rabbit and rat aortic rings completely reversed the relaxations. ECL (1.5µg/mL) was also able to induce relaxations in rabbit abdominal aorta in the presence of L-NNA (100µM, 20 minutes) (Figure 2F). The magnitude of these relaxations was smaller than the ones observed in the absence of L-NNA.

Figure 2

Representative tracings showing the reversion of extract of Combretum leprosum-induced (ECL-induced) relaxations by hydroxocobalamin (B12a; 100µM,) or L-NG-nitro-L-arginine (L-NNA; 300µM) on rings of rabbit thoracic aorta (A, B) or rat thoracic aorta (C, D). Representative tracings showing ECL-induced relaxations in the absence (E; n=8) and in the presence of L-NNA (F; 100µM, n=7) in rabbit abdominal aortic rings. Right panels (A-D) show the mean ± standard error of the mean (SEM) values of tension of 4-8 similar experiments (tension expressed as a percentage of phenylephrine - PE-induced contraction). **Two-tailed p=0.0041 (unpaired t-test); ***two-tailed p<0.0001 (paired t-test). Right panel (E-F) shows the mean ± SEM values of the magnitude of ECL-induced relaxation (relaxation magnitude, expressed as a percentage of reduction of PE-induced contraction)

In experiments designed to calculate the potency of the extract by the single concentration method using the same rabbit thoracic aorta ring, it was observed that the magnitude of the relaxation induced by low concentrations (0.1 to 0.3µg/mL) of ECL increased with successive additions and required at least three additions of the same concentration at hourly intervals in order to become stabilized (Figures 3A and 3B); furthermore it was observed that an initial priming of the rings with 1µg/mL was also required. In these conditions the calculated EC50 was 0.2µg/mL (95% confidence interval − 95%CI=0.17-0.25) (Figure 3C).

Figure 3

Representative tracings showing the effect of low concentrations of extract of Combretum leprosum (ECL) on rings from rabbit thoracic aorta pre-constricted with phenylephrine (PE). The small concentrations of ECL were added in a non-cumulative manner after “priming” of preparations with ECL (1.0µg/mL) and reversion of ECL-induced relaxations by hydroxocobalamin (B12a; 100µM). It can be observed that the magnitude of ECL (0.1-0.3µg/mL)-induced relaxations increased in the first additions and became stabilized only after the 4th or 5th hour (A and B). Panel C shows the concentration-effect curve (mean ± standard error of the mean - SEM values) observed after the 4 hours (**two-tailed p<0.0067, paired t-test). Panel D shows that the magnitude of PE-induced contraction was reduced even removing ECL (1.5µg/mL) from the chamber and the recovery of contraction by B12a addition. W= washout of the preparation for 60-45 minutes; EC50: half-maximal relaxation; 95%CI: 95% confidence interval

Interestingly, the magnitude of contractions elicited by PE after washing out the extract, especially at the higher concentrations (1 to 1.5µg/mL), did not return to that observed before adding the extract. For example, the magnitude of PE-induced contractions 1 hour after washing out the ECL (1.5µg/mL) was 0.62±0.11g (n=4), which is significantly lower than 2.22±0.15g (n=4) observed before adding ECL. Furthermore, the magnitude of PE-induce contractions remained reduced (1.17±0.14g; n=4) even 4 hours after washing out ECL, whereas the addition of B12a increased the magnitude of PE-induced contraction (which was decreased 1 hour after ECL washout) from 0.30±0.04g (n=4) to 3.70±0.21g (n=4) (Figure 3D).

Considering that endothelial cells require the presence of Ca2 in the extracellular medium in order to produce NO and EDHF (endothelium-derived hyperpolarization factor), we determined whether the effect of ECL was affected by absence of extracellular Ca2. As shown in figures 4A and 4B, when rabbit thoracic aorta, rat thoracic aorta, and pig right coronary artery rings were incubated in Krebs solution without Ca2 (-Ca2), the magnitude of ECL-induced relaxations was significantly reduced. In order to identify pharmacologically the putative Ca2 influx pathways activated by ECL, the effect of RR was next examined. In rabbit thoracic aorta rings, the addition of RR (10µM) on the plateau of ECL-induced relaxations reversed almost completely such relaxations (Figures 4C and 4D). Similar results were observed in rings from rat and mice thoracic aorta.

Figure 4

Representative tracings showing the effect of extract of Combretum leprosum (ECL; 1.5µg/mL) on the isometric tension developed by rings of rabbit thoracic aorta pre-constricted with phenylephrine (PE), in A, in the presence (+ Ca2+) or absence (- Ca2+) of extracellular Ca2+. In B, the mean ± standard error of the mean - SEM values of the magnitude of relaxation (relaxation magnitude expressed as a percentage reduction of PE- or U46619-induced contraction) of four similar experiments in rings from thoracic rabbit aorta, thoracic rat aorta, and right coronary pig artery. In C, the reversion of ECL-induced relaxations by ruthenium red (RR, 10µM) and D shows the mean ± SEM values of tension of three similar experiments (tension expressed as a percentage PE-induced contraction). **Two-tailed p<0.001 or ***p<0.0001 (paired t-test). W: washout of the preparation for 60 minutes; -Ca2+: washing and incubation with Krebs solution for 30 minutes

Because tree barks are rich in polyphenol compounds, the amount of total polyphenols present in the ECL was estimated using the FC method using GA as standard of polyphenol-like reactive compounds. From the linear regression equation relating absorbance and gallic acid concentration (y=0.0578 x -0.0348), it was calculated that a solution of 12.5mg/mL of ECL contained 4.94mg/mL (approximatively 39.5%) of gallic acid equivalents.

DISCUSSION

The present study showed for the first time that ECL produced relaxations of isolated arterial rings from different animal species, which indicated that the bark of C. leprosum contains bioactive compounds capable of influencing the function of blood vessels. Extracts or isolated compounds of C. leprosum have been previously shown to exhibit antinociceptive,[8-11] anticholinesterase,[12] antiulcerogenic,[13] antileishmanial,[14] anti-inflammatory, and antiproliferative effects;[15,16] however, to our knowledge, the vascular effects described in the present work have not been mentioned previously.

The fact that the effect was observed at relative low concentrations (0.1 to 1.0µg/mL), and, considering that it is crude extract that may contain hundreds of different compounds, indicates that the bioactive compound responsible for the effect is either the most abundant, or if present in small amounts, is extremely potent; alternatively the effect may be caused by the synergistic action of different compounds. Such synergism has been described for polyphenols present in red wine extract (RWP), for instance, the EC50 of raw RWP to induce EDR in rat aorta is 0.53 to 0.63µg/mL, while the EC50 of pure delphinidin or leucocyanidol, polyphenol compounds isolated from RWP, are 8.91µg/mL and 1.77µg/mL, respectively.[17,18] Substances identified in other Combretum genera members are also capable of inducing EDR in rat aortas; however the concentrations required are higher than those of ECL; for example, 5 to 80µg/mL (to mollic acid glucoside isolated from C. molle leaf) and EC50 of 3.9µg/mL and 9.5µg/mL for methanolic extract of C. celastroides leaves, and C. racemosum roots respectively.[3,4] As in the rat aorta, 1.5µg/mL of ECL causes complete relaxation of PE-induced contractions the vasodilator in the extract of compounds present in ECL are unlikely to be related to those already described in other members of the genus Combretum.

The endothelial cells might constitute the main site of action of the bioactive compounds present in the ECL, this suggestion is based on the observation that it requires an intact endothelium to cause relaxation in all the arteries examined. Alternatively, the ECL could be acting on the vascular smooth cells to enhance their responsiveness to relaxing factors produced basally by the endothelium like as the phosphodiesterase inhibitors but the relaxations caused by these inhibitors is still present in endothelium denuded rings from rat or rabbit thoracic aorta.[19,20] In fact, such mechanism has been recently proposed for the relaxant effect of a dichloromethane fraction from Anogeissus leiocarpus, a combretaceae.[21]

Considering that ECL-relaxed thoracic aorta rings from both rabbits and rats in which BK has no effect[6] and that histamine relaxes rat thoracic aorta but not rabbit thoracic aorta,[22] together with the fact that it relaxes rings from pig coronary arteries in which ACh causes contraction would suggest that the mechanisms involved in its action are different from those involved in the action of classical receptor agonists which cause EDR. In addition, the kinetic characteristics of ECL-induced relaxation such as slower initiation and longer time for attaining the steady state clearly distinguish its effects from those caused by ACh and BK and histamine. Furthermore, the fact that the effect remained for at least 4 hours after removing the extract contrasts with the transient relaxation caused by ACh or BK whose effects are not already evident 0.5 to 1 hour after removing them from the organ bath.

As in some arteries (rabbit superior mesenteric and common carotid arteries, as well as from pig coronary artery and from guinea-pig thoracic aorta) ECL is able to cause EDR in the presence of NOS inhibitors, we suggest that its effect is apparently related to the activation of endothelial cells to produce whatever relaxing factor is being predominantly produced. It has been thoroughly described that endothelial cells are heterogeneous in terms of responsiveness to agonists and relaxing factors being produced; for instance, endothelial cells from small arteries and arterioles produce mainly EDHF, whereas endothelial cells from the aorta produce almost exclusively NO.[23]

Our results showing that a major part of ECL-induced EDR requires the presence of extracellular Ca2 indicate that ECL action is related to the activation of Ca2 influx in endothelial cells. Although the pathways mediating Ca2 influx in endothelial cells have not been yet entirely elucidated, the fact that RR was able to revert ECL-induced relaxations would suggest that one or more of the various RR-sensitive Ca2 permeable channels[24] is activated directly or indirectly by bioactive compounds in the extract.

There are good reasons to suggestion that polyphenol compounds could constitute the active principles accounting for the ECL effect. First, substances with polyphenol-like chemical reactivity are present in ECL in substantial amounts (approximately 40% w/w). Second, plant-derived polyphenols have been shown to cause EDR in several arterial segments.[25] Third, previous studies have shown the presence of a variety of compounds, including polyphenols, in the ethanol extracts of flowers, leaves, roots, fruits, and bark from C. leprosum, such as flavonoids,[12,26,27] triterpenes,[26-28] mono- and oligosaccharides, fatty acids, sterols,[12,27,28] and stilbenes.[29]

Finally the description of long-lasting vasorelaxing effect of ECL might be clinically relevant since it could lead to the development of potential new therapeutic approaches for pathological conditions in which blood flow is reduced or impaired due to increased vascular tonus such as hypertension and vasoespastic disorders. More experiments are necessary to establish the therapeutic potential of ECL, for instance we need to answer the questions: What are effects of ECL upon blood circulation in intact animals? What are the active compounds present in the extract? What are the mechanisms by which the ECL promotes synthesis and release of endothelial factors?

CONCLUSION

The present findings showed for the first time that an aqueous suspension of a lyophilized hydroalcoholic extract of Combretum leprosum causes relaxation of arterial rings isolated from different animal species. These Combretum leprosum extract-induced relaxations were completely dependent on a functional endothelium and appear to be mediated by the release of endothelial relaxing factors such as nitric oxide in the rat or rabbit thoracic aorta or by nitric oxide and others factors non-derived from nitric oxide synthases or cyclooxygenase activity in rabbit abdominal aorta and pig coronary arteries. Finally, since Combretum leprosum extract requires Ca2 influx through ruthenium red-sensitive pathways to cause relaxation the elucidation of its mechanism of action, this could reveal a new approach to activate endothelial cells to produce and release relaxing factors.

INTRODUÇÃO

Combretum leprosum Mart. (Combretaceae) é um arbusto ou pequena árvore que cresce no Nordeste do Brasil, onde é conhecido como mufumbo, mofumbo, cipoaba e pente-de-macaco. Na medicina popular, os extratos de diferentes partes da planta são utilizados por suas propriedades supostamente expectorantes, hemostáticas, sedativas e afrodisíacas.[1,2]

Em uma triagem baseada na bioatividade dos possíveis efeitos do extrato hidroalcoólico liofilizado da casca de Combretum leprosum (ECL) em músculos lisos viscerais e vasculares, observou-se que o extrato causou um potente relaxamento dependente do endotélio (endothelium-dependent relaxation - EDR)dos anéis da aorta torácica de coelho. Embora tenha sido descrito que substâncias isoladas de espécies relacionadas do gênero Combretum causam EDR na aorta de ratos (glicosídeo ácido móllico isolado do Combretum molle), bem como frações metanólicas ricas em flavonoides de Combretum celastroides e Combretum racemosum,[3,4] todos os efeitos de extratos de flores, folhas e/ou raízes de ECL previamente descritos não incluem nenhuma bioatividade cardiovascular.

As células endoteliais exibem uma heterogeneidade notável na resposta a agentes que induzem ao EDR seja de artérias homólogas de diferentes espécies animais ou de artérias de diferentes leitos vasculares do mesmo animal; por exemplo, a acetilcolina (ACh), mas não a bradicinina (BK), induz ao EDR na aorta de coelho e de rato;[5,6] de forma semelhante, a histamina causa EDR na aorta de rato, mas não na de coelho. Assim, ao descrever o EDR de uma nova droga ou produto natural, é altamente recomendado analisar seus efeitos na mesma artéria em mais de uma espécie animal e em diferentes artérias do mesmo animal.

OBJETIVO

Descrever e interpretar os resultados de experimentos concebidos para responder às seguintes perguntas relacionadas ao novo efeito observado do extrato de Combretum leprosum: (1) Qual o local de ação, a potência e a duração do efeito do extrato de Combretum leprosum para provocar relaxamentos dos anéis da aorta torácica de coelho? (2) O extrato de Combretum leprosum é capaz de causar relaxamento dependente do endotélio em anéis arteriais isolados de outros vasos de coelho ou de vasos de rato, camundongo, cobaia e porco? (3) Quais os possíveis mecanismos envolvidos no relaxamento induzido por extrato de Combretum leprosum dos anéis da aorta torácica de coelho?

MÉTODOS

Material vegetal

A casca do tronco de C. leprosum foi coletada pela manhã (entre 10 e 11h) no dia 15 de julho de 2005 no Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Piauí, em Teresina (PI), Brasil. Uma amostra (número 10.557) foi depositada no Herbário Graziela Barroso (TEPB, na mesma instituição). O material vegetal passou por secagem à sombra a 40±1ºC, e o pó da casca do tronco (500g) passou por extração (três vezes) com 1L de etanol a 70%. O extrato hidroalcoólico foi evaporado em vácuo a 50°C e liofilizado para a obtenção de um extrato seco, que foi armazenado sob refrigeração (4°C) até o uso. O extrato foi diluído novamente em água destilada para os experimentos.

Experimentos com órgãos isolados

Trinta coelhos neozelandeses machos e fêmeas (2,5 a 3,5kg), 20 ratos Wistar (200 a 250g), 5 cobaias inglesas (350g) e 10 camundongos machos (24 a 30g) foram utilizados em todos os experimentos. Os animais foram obtidos junto ao biotério do Campus de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Os corações de dez porcos foram obtidos de um abatedouro local, tendo sido removidos imediatamente após o óbito do animal, lavados com solução de Krebs fria para remover a maior parte do sangue, e depois transportados para o laboratório em sacos plásticos lacrados acondicionados em um isopor com gelo picado. Duas a três horas após a remoção do coração dos animais, as artérias coronárias direita e/ou esquerda foram dissecadas para preparação dos anéis arteriais. Todos os protocolos experimentais seguiram os princípios éticos para experimentação em animais recomendados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal (número 084/2011) da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.

Os ratos, camundongos, cobaias e coelhos foram sacrificados utilizando anestesia com pentobarbital sódio (50mg/kg i.p. para os ratos, camundongos e cobaias e/ou por injeção na veia marginal da orelha nos coelhos). A aorta torácica descendente (de todos os animais), além da aorta abdominal, da artéria mesentérica superior e da artéria carótida comum (dos coelhos), foi rapidamente removida e colocada em solução de Krebs (116mM de cloreto de sódio − NaCl; 4,5mM de cloreto de potássio − KCl; 1,14mM de fosfato monossódico − NaH2PO4; 1,16mM de cloreto de magnésio − MgCl2; 2,5mM de cloreto de cálcio − CaCl2; 25mM de bicarbonato de sódio − NaHCO3; e 11,1nM de D-glicose) contendo diclofenaco (10µM) para inibir a síntese de produtos derivados da ciclo-oxigenase.[6] Após a remoção de todos os tecidos aderentes, as artérias foram seccionadas em anéis (3 a 4mm), com cuidado para preservar o endotélio. Quando necessário, esfregou-se a túnica íntima de alguns dos anéis com uma varinha de aço para destruir o endotélio. Os anéis foram suspensos entre suportes metálicos finos e colocados sob uma tensão inicial de 2 a 4g em cubas para órgão isolado (volume: 5 a 10mL) contendo solução de Krebs a 37±1°C borbulhado continuamente com 5% de dióxido de carbono (CO2) − 95% de oxigênio (O2). A tensão isométrica de cada anel foi registrada continuamente e arquivada utilizando o sistema de aquisição de dados Lab Chart.

Protocolos experimentais

Para testar a viabilidade dos anéis, concentrações submáximas de fenilefrina (Phenylephrine - PE) (PE; 0,1 a 1μmol/L) ou U46619 (10 a 30nmol/L) foram adicionadas duas vezes, de hora em hora. Durante o platô de contração induzido pela segunda adição de PE (ou U46619), a integridade funcional do endotélio foi testada mediante a adição de ACh (1μmol/L) ou BK (0,1μmol/L, artéria coronária de porco). Os anéis nos quais a ACh (ou a BK) causou uma queda de ao menos 80% da tensão induzida por PE (ou U46619) foram considerados como contendo endotélio funcional intacto. Uma hora após a determinação da funcionalidade do endotélio, foi novamente adicionada PE (ou U46619) para a contração dos anéis, e uma concentração supramáxima de ECL (1,5μg/mL) foi adicionada.

Para determinar se a síntese e/ou a liberação de óxido do nítrico (Nitric Oxide - NO) eram necessárias para o relaxamento induzido por ECL, L-NG-nitro-L-arginina (L-NNA; 300μmol/L) ou hidroxocobalamina (B12a; 30 a 100μM) foram adicionadas quando o relaxamento induzido por ECL atingiu um patamar estável. Para determinar se o relaxamento induzido por ECL requeria a presença de Ca2extracelular, o efeito do ECL foi testado em preparações incubadas em solução de Krebs contendo nominalmente zero Ca2. Para determinar se o influxo de Ca2 nas células endoteliais estava envolvido no relaxamento induzido por ECL, foi determinado o efeito da adição de vermelho de rutênio ruthenium red - RR; 10μmol/L, um bloqueador não seletivo dos canais permeáveis de Ca2) quando a resposta de relaxamento induzida por ECL atingiu a estabilidade também.

A potência do ECL foi calculada a partir de curvas concentração-efeito obtidas de forma não cumulativa utilizando anéis de aorta torácica de coelho com endotélio intacto, isto é, foi adicionada uma única concentração de ECL (0,1, 0,3 e 1,0µg/mL) por vez no platô das contrações induzidas por PE em intervalos de 45 a 60 minutos. Todas as drogas e as soluções de extratos foram adicionadas no meio das cubas com uma pipeta num volume de 1 a 30µL.

Mensuração dos polifenóis

Para estimar os grupos fenólicos OH totais, foi utilizado o método Folin-Ciocalteu (FC).[7] As soluções de ECL (0,5mg/mL) foram diluídas em hidróxido de sódio (NaOH) aquoso (1%) para produzir soluções com as seguintes concentrações: 1,0, 2,5, 5,0, 7,5, 10, e 12,5µg/mL. A essas soluções, foram adicionados 500µL de reagente FC, o que foi seguido de agitação vigorosa por 2 minutos. Depois, foram adicionados 500µL de carbonato de sódio (Na2CO3; 75g/mL), e essas soluções foram incubadas a temperatura ambiente ou a 50°C, por 20 minutos. As incubações foram finalizadas mediante resfriamento das soluções pela imersão em banhos de gelo por 5 minutos. A absorbância específica de 700nm foi determinada utilizando uma leitora de placas de Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA); as análises foram realizadas em triplicado. Soluções de ácido gálico (AG) e quercetina (dissolvida em água contendo 10% metanol) foram utilizadas como compostos polifenóis padrão.

Análises estatísticas

O relaxamento induzido por ECL em anéis arteriais foi expresso como a porcentagem de redução (% de tensão) da tensão desenvolvida por contrações induzidas por PE ou U46619. A reversão desse relaxamento por inibidores foi expressa como porcentagem da magnitude de relaxamento (% de relaxamento). Os valores foram apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). A concentração de ECL que causa a metade do relaxamento máximo (EC50) foi determinada pelo ajuste da curva concentração-resposta original a uma curva sigmoide utilizando o programa GraphPad Prism Software, versão 5.0. Os valores (em porcentagem) das mudanças de tônus foram analisados pelo teste t de Student (bicaudal), pareado (no mesmo anel arterial) ou não pareado (em anéis arteriais diferentes). Os valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Substâncias químicas

ACh, BK, reagente de FC, AG, B12a, PE, quercetina, etanol de grau reagente, RR e U46619 foram obtidos da Sigma (Estados Unidos). O diclofenaco foi obtido da Calbiochem (Estados Unidos). A L-NNA foi obtida da Research Biochemicals International (Estados Unidos).

RESULTADOS

Experimentos iniciais utilizando anéis da aorta torácica de coelhos com endotélio intacto mostraram que uma suspensão aquosa de ECL na concentração de 1,0 a 1,5µg/mL causou relaxamentos de magnitude semelhante ou até maiores do que os causados pela Ach (1µM) (Figura 1A). Enquanto os relaxamentos provocados pela ACh tiveram início quase imediatamente após sua adição, aqueles provocados pelo ECL precisaram de 60 a 90 segundos até se tornarem aparentes; ademais, enquanto o efeito relaxante da ACh atingiu um platô em aproximadamente 2 minutos, os efeitos induzidos pelo ECL levaram aproximadamente 10 minutos para atingir o platô. A velocidade máxima do relaxamento, calculada a partir da primeira derivada (dT/dt), foi de -90,33±5,41mg/s (n=8) e de -39,83±2,28mg/s (n=8) para a ACh (1µM) e o ECL (1,0µg/mL), respectivamente (Figura 1B).

Figura 1

Traçados representativos mostrando o efeito da acetilcolina (ACh; 1µM) e do extrato de Combretum leprosum (ECL; 1,0µg/mL) sobre a tensão isométrica desenvolvida pelos anéis da aorta torácica de coelho pré-contraídos com fenilefrina (PE; 100nM) (A). Primeira derivada (dT/ dt, mg/s) dos relaxamentos induzidos por ECL (1,0µg/mL) e ACh (1µM) (B). Efeito do ECL (1,5µg/mL) sobre a tensão isométrica desenvolvida pelos anéis, com (+E) ou sem (-E) o endotélio, da aorta torácica de coelho (C), da aorta torácica de rato (D) pré-contraída com PE, e da artéria coronária direita de suínos pré-contraída com U46619 (E). Em (F), valores médios ± erro padrão da média (EPM) da magnitude do relaxamento observado em 4-20 experimentos semelhantes (a magnitude de relaxamento é expressa como porcentagem da magnitude das contrações induzidas por PE ou U46619). ***Teste bicaudal p<0,0001 (teste t não pareado). L: lavagem da preparação por 60 a 45 minutos

O relaxamento induzido por ECL pode ser devido a uma ação direta sobre as células musculares lisas ou a uma ação indireta mediada pelo endotélio, como já está bem estabelecido para a ACh e outros agentes.[5] Para distinguir entre essas alternativas, o efeito do ECL foi determinado em anéis da aorta torácica de coelho contendo endotélio ou em anéis nos quais o endotélio foi removido, como pode ser observado na figura 1C, que mostra que o ECL não causou relaxamento em anéis sem endotélio.

Para determinar se o ECL causa EDR em outras artérias de coelho ou em artérias de outras espécies animais, o efeito do ECL foi determinado em anéis da aorta abdominal de coelho, da artéria mesentérica superior de coelho, da artéria carótida comum de coelho, da aorta torácica de rato, da aorta torácica de cobaia, da aorta torácica de camundongo e das artérias coronárias de suínos. Conforme apresentado nas figuras 1D e 1E, o ECL a 1,5µg/mL causou relaxamentos que também foram estritamente dependentes do endotélio nos anéis da aorta torácica de rato e da artéria coronária direita de suínos. Achados semelhantes foram observados em todas as outras artérias testadas.

Na aorta torácica de coelho e de rato, os EDR são inteiramente mediados por NO; portanto, foi analisado o efeito de um inibidor de síntase de óxido nítrico (NitricOxide Synthase - NOS) (L-NNA) e de um sequestrador de NO (B12a) sobre os EDR induzidos por ECL. Conforme apresentado nas figuras 2A a 2E, a adição de L-NNA ou de B12a no platô do relaxamento induzido por ECL nos anéis de aorta de coelho e rato reverteu completamente o relaxamento. O ECL (1,5µg/mL) também foi capaz de induzir relaxamentos na aorta abdominal de coelho na presença de L-NNA (100µM por 20 minutos) (Figura 2F). A magnitude desses relaxamentos foi menor do que aqueles observados na ausência de L-NNA.

Figura 2

Traçados representativos mostrando a reversão de relaxamento induzido por extrato de Combretum leprosum (ECL) por hidroxocobalamina (B12a; 100µM) ou L-NG-nitro-L-arginina (L-NNA; 300µM) nos anéis da aorta torácica de coelho (A, B) ou de rato (C, D). Em (E e F), traçados representativos mostrando o relaxamento induzido por ECL na ausência (E; n=8) e na presença de L-NNA (F; 100µM, n=7) em anéis da aorta abdominal de coelho. Os painéis do lado direito (A-D) mostram os valores médios ± erro padrão da média (EPM) da tensão de 4-8 experimentos semelhantes (tensão expressa como uma porcentagem da contração induzida por fenilefrina - PE). **Teste bicaudal p=0,0041 (teste t não pareado); ***teste bicaudal p<0,0001 (teste t pareado). O painel do lado direito (E-F) mostra os valores médios ± EPM do relaxamento induzido por ECL (magnitude do relaxamento expresso como porcentagem da contração induzida por PE)

Em experimentos planejados para calcular a potência do extrato por meio do método não cumulativo utilizando o mesmo anel da aorta torácica de coelho, observou-se que a magnitude do relaxamento induzido por baixas concentrações (0,1 a 0,3µg/mL) de ECL aumentou com adições sucessivas e foram necessárias ao menos três adições da mesma concentração a cada hora para atingir a estabilidade (Figuras 3A e 3B); ademais, observou-se que uma pré-ativação inicial dos anéis com 1µg/mL também foi necessária. Nessas condições, o EC50 calculado foi de 0,2µg/mL (intervalo de confiança de 95% − IC 95%=0,17-0,25) (Figura 3C).

Figura 3

Traçados representativos mostrando o efeito de baixas concentrações de extrato de Combretum leprosum (ECL) sobre os anéis da aorta torácica de coelho pré-contraídos com fenilefrina (PE). As concentrações de ECL foram adicionadas de forma não cumulativa após a “ativação” das preparações com ECL (1,0µg/mL) (A), assim como a reversão do relaxamento induzido por ECL por hidroxocobalamina (B12a; 100µM). Pode-se observar que a magnitude do relaxamento induzido por ECL (0,1-0,3µg/mL) aumentou progressivamente com as adições sucessivas e se estabilizou somente após a quarta ou quinta hora (A e B). O painel C mostra a curva de concentração-efeito (valores médios ± erro padrão da média - EPM) observada após as 4 horas (**teste bicaudal p<0,0067, teste t pareado). Em D, um traçado representativo mostrando que a magnitude das contrações induzidas por PE permaneceu reduzida mesmo 1 hora após a remoção do ECL (1,5µg/mL) da cuba e a recuperação da contração por meio da adição de B12a. L: lavagem da preparação por 60 a 45 minutos; EC50: metade do relaxamento máximo; IC95%: intervalo de confiança de 95%

Curiosamente, a magnitude das contrações provocadas por PE após a lavagem do extrato, especialmente nas concentrações mais altas (1 a 1,5µg/mL), não retornou aos níveis observados antes da adição do extrato. Por exemplo, a magnitude das contrações induzidas por PE 1 hora após a lavagem do ECL (1,5µg/mL) foi de 0,62±0,11g (n=4), que é significativamente menor do que os 2,22±0,15g (n=4) observados antes da adição de ECL. Além disso, a magnitude da contração induzida por PE permaneceu reduzida (1,17±0,14g; n=4), mesmo 4 horas após a lavagem do ECL, enquanto a adição de B12a aumentou a magnitude da contração induzida por PE (a qual estava diminuída 1 hora após a lavagem do ECL) de 0,30±0,04g (n=4) para 3,70±0,21g (n=4) (Figura 3D).

Considerando que as células endoteliais requereram presença de Ca2 no meio extracelular para produzir NO e fator hiperpolarizante derivado do endotélio (endothelium-derived hyperpolarizing factors - EDHF) determinamos se o efeito do ECL era afetado pela ausência de Ca2extracelular. Conforme apresentado nas figuras 4A e 4B, quando os anéis da aorta torácica de coelho, da aorta torácica de rato e da artéria coronária direita de porco foram incubados em uma solução de Krebs sem Ca2 (- Ca2), a magnitude dos relaxamentos induzidos por ECL foi reduzida significativamente. A fim de identificar farmacologicamente as possíveis vias de influxo de Ca2 ativadas pelo ECL, foi analisado, a seguir, o efeito do RR. Nos anéis da aorta torácica de coelho, a adição de RR (10µM) no platô do relaxamento induzido por ECL reverteu quase totalmente esse relaxamento (Figuras 4C e 4D). Resultados semelhantes foram observados em anéis da aorta torácica de ratos e camundongos.

Figura 4

Traçados representativos mostrando o efeito do extrato de Combretum leprosum (ECL; 1,5µg/mL) sobre a tensão isométrica desenvolvida pelos anéis da aorta torácica de coelho pré-contraídos com fenilefrina (PE) (A), na presença (+Ca2+) ou ausência (-Ca2+) de Ca2+ extracelular. Em B, valores médios ± erro padrão da média (EPM) da magnitude do relaxamento (magnitude do relaxamento expresso como porcentagem da redução da contração induzida por PE ou U46619) de quatro experimentos semelhantes em anéis da aorta torácica de coelho e da artéria coronária de porco. Em C, reversão do relaxamento induzido por ECL pelo vermelho de rutênio (RR, 10µM) e, em D, os valores médios ± EPM da tensão de três experimentos semelhantes (tensão expressa como porcentagem da contração induzida por PE). **Teste bicaudal p<0,001 ou ***p<0,0001 (teste t pareado). L: lavagem da preparação por 60 minutos; -Ca2+: lavagem e incubação com solução de Krebs por 30 minutos

Como as cascas de árvore são ricas em compostos polifenóis, a quantidade total de polifenóis presente no ECL foi estimada utilizando-se o método de FC, empregando o ácido gálico como o padrão de compostos polifenólicos. A partir da equação de regressão linear relacionando a absorbância e a concentração de ácido gálico (y=0,0578 x -0,0348), calculou-se que uma solução de 12,5mg/mL de ECL continha 4,94mg/mL (aproximadamente 39,5%) de equivalentes de ácido gálico.

DISCUSSÃO

O presente estudo mostrou, pela primeira vez, que o ECL produziu relaxamentos de anéis arteriais isolados de diferentes espécies animais, o que indicou que a casca de C. leprosum contém compostos bioativos capazes de influenciar a função de vasos sanguíneos. Demonstrou-se anteriormente que extratos ou compostos isolados de C. leprosum exibiram efeitos antinociceptivos,[8-11] anticolinesterásicos,[12] antiulcerogênicos,[13] antileishmania,[14] anti-inflamatórios e antiproliferativos;[15,16] no entato, até onde sabemos, os efeitos vasculares descritos no presente trabalho não foram mencionados anteriormente.

O fato de que o efeito foi observado em concentrações relativamente baixas (0,1 a 1,0µg/mL) e, considerando que se trata de um extrato bruto que pode conter centenas de diferentes compostos, trata-se de uma indicação de que o composto bioativo responsável pelo efeito é o mais abundante ou, quando presente em pequenas quantidades, é extremamente potente; por outro lado, o efeito pode ser causado também pela ação sinérgica de diferentes compostos. Tal sinergismo tem sido descrito para os polifenóis presentes no extrato de vinho tinto (RWP), por exemplo, o EC50 dos RWP brutos para induzir ao EDR na aorta do rato é de 0,53 a 0,63µg/mL, enquanto o EC50 da delfinidina ou do leucocianidol puros, compostos polifenóis isolados dos RWP, é de 8,91µg/mL e 1,77µg/mL, respectivamente.[17,18] As substâncias identificadas em outros membros do gênero Combretum também são capazes de induzir ao EDR nas aortas de ratos. No entato, as concentrações necessárias são mais altas do que as de ECL; por exemplo, 5 a 80µg/mL (para o glicosídeo do ácido mólico isolado da folha de C. molle) e uma EC50 de 3,9µg/mL e 9,5µg/mL para o extrato metanólico das folhas de C. celastroides e das raízes de C. racemosum, respectivamente.[3,4] Em contraste, na aorta de rato, 1,5µg/mL do ECL foi capaz de causar um relaxamento completo das contrações induzidas por PE. Os compostos vasodilatadores presentes no ECL provavelmente não estão relacionados àqueles já descritos em outros membros do gênero Combretum.

As células endoteliais podem constituir o principal sítio de ação dos compostos bioativos presentes no ECL. Essa sugestão se baseia na observação de que é necessário um endotélio intacto para causar o relaxamento em todas as artérias examinadas. Por outro lado, o ECL pode atuar nas células lisas vasculares, aumentando sua reatividade aos fatores de relaxamento produzidos basalmente pelo endotélio, como os inibidores da fosfodiesterase, mas os relaxamentos causados por esses inibidores ainda estão presentes nos anéis sem endotélio da aorta torácica de rato ou coelho.[19,20] Na verdade, tal mecanismo foi proposto recentemente para o efeito relaxante de uma fração diclorometano de Anogeissus leiocarpus, um combretáceo.[21]

Considerando que a BK não tem qualquer efeito sobre os anéis da aorta torácica de coelho e de rato[6] e que a histamina relaxa a aorta torácica de rato, mas não a de coelho,[22] juntamente do fato de, nas artérias coronárias de porco, a ACh causar contração, sugere-se que os mecanismos envolvidos nessa ação são diferentes daqueles envolvidos na ação de agonistas de receptores que causam EDR. Além disso, as características cinéticas do relaxamento induzido por ECL, como um início mais lento e um maior tempo até atingir a estabilidade, distinguem claramente seu efeito daquele causado pela ACh, BK e histamina. Ademais, o fato de que o efeito permaneceu por pelo menos 4 horas após a remoção do extrato contrasta com o relaxamento temporário causado pela ACh ou BK, cujos efeitos já não são evidentes após 0,5 a 1 hora de sua remoção do banho.

Já que em algumas artérias (a artéria mesentérica superior e as artérias carótidas comuns de coelho, bem como a artéria coronária de porco e a aorta torácica de cobaias) o ECL é capaz de causar EDR na presença de inibidores de NOS, sugerimos que seu efeito está aparentemente relacionado à ativação das células endoteliais, para produzir qualquer fator de relaxamento que esteja sendo predominantemente produzido. Foi amplamente descrito que as células endoteliais são heterogêneas em termos de resposta a agonistas e dos fatores de relaxamento que são produzidos; por exemplo, as células endoteliais de pequenas artérias e arteríolas produzem principalmente EDHF, enquanto as células endoteliais da aorta torácica produzem quase que exclusivamente NO.[23]

Nossos resultados mostrando que uma grande parte de EDR induzidos por ECL que requerem a presença de Ca2 extracelular indicam que a ação do ECL está relacionada à ativação do influxo de Ca2 em células endoteliais. Apesar das vias que medeiam o influxo de Ca2 nas células endoteliais não terem sido inteiramente elucidadas, o fato de o RR ter sido capaz de reverter o relaxamento induzido por ECL sugere que um ou mais dos vários canais permeáveis de Ca2 sensíveis ao RR[24] são ativados diretamente ou indiretamente pelos compostos bioativos presentes no extrato.

Existem evidências para sugerir que os compostos polifenóis podem constituir os princípios ativos responsáveis pelo efeito do ECL. Primeiramente, substâncias com reatividade química semelhante à dos polifenóis estão presentes no ECL em quantidades significativas (aproximadamente 40%m/m). Em segundo lugar, demonstrou-se que polifenóis derivados de plantas causam EDR em vários segmentos arteriais.[25] Em terceiro lugar, estudos anteriores mostraram a presença de uma variedade de compostos, incluindo os polifenóis, em extratos etanólicos de flores, folhas, raízes, frutas e casca de C. leprosum, tais como flavonoides[12,26,27], triterpenos,[26-28] mono e oligossacarídeos, ácidos graxos, esteróis,[12,27,28] e estilbenos.[29]

Finalmente, a descrição desse efeito vasorrelaxante de longa duração do causado pelo ECL pode ser clinicamente relevante, já que pode levar ao desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas potenciais para condições patológicas nas quais o fluxo sanguíneo esteja reduzido por causa do tônus vascular aumentado, tal como a hipertensão e as doenças vasoespásticas. Mais experimentos são necessários para estabelecer o possível efeito terapêutico do ECL. Por exemplo, precisamos responder às seguintes perguntas: quais são os efeitos do ECL sobre a circulação sanguínea em animais intactos? Quais são os compostos ativos presentes no extrato? Quais são os mecanismos por meio dos quais o ECL promove a síntese e a liberação de fatores endoteliais?

CONCLUSÃO

Os presentes achados mostraram, pela primeira vez, que uma suspensão aquosa de um extrato hidroalcoólico liofilizado de Combretum leprosum causa relaxamento de anéis arteriais isolados de diferentes espécies animais. Esse relaxamento foi completamente dependente de um endotélio funcional e parece ser mediado pela liberação de fatores relaxantes derivados do endotélio, tais como óxido nítrico na aorta torácica de rato ou de coelho, ou por óxido nítrico e outros fatores não derivados da atividade de óxido nítrico sintetase ou ciclo-oxigenase na aorta abdominal de coelho e nas artérias coronárias de porco. Finalmente, como o extrato de Combretum leprosum exige um influxo de Ca2 por meio de vias sensíveis ao vermelho de rutênio para causar o relaxamento, para a elucidação de seu mecanismo de ação, isso pode revelar uma nova abordagem para ativar células endoteliais a produzirem e liberarem fatores de relaxamento.