Diagnosis of primary ciliary dyskinesia.

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a genetic disorder of ciliary structure or function. It results in mucus accumulation and bacterial colonization of the respiratory tract which leads to chronic upper and lower airway infections, organ laterality defects, and fertility problems. We review the respiratory signs and symptoms of PCD, as well as the screening tests for and diagnostic investigation of the disease, together with details related to ciliary function, ciliary ultrastructure, and genetic studies. In addition, we describe the difficulties in diagnosing PCD by means of transmission electron microscopy, as well as describing patient follow-up procedures.

"Ciliary beating was one of the first characteristics-the Alpha-of animal life on Earth, and it will be the last-the Omega." - J. C. de Man, Dutch physician and historian

Introduction

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a disease characterized by a change in ciliary beat frequency, ciliary beat pattern, or both and has a heterogeneous genetic basis, typically being an autosomal recessive disorder; the main consequence of ciliary dysfunction is a reduced efficiency of mucociliary clearance of the upper and lower airways, leading to chronic infections and inflammation.( 1 , 2 )

Few countries have records of the prevalence, diagnosis, and prognosis of PCD, the data varying greatly across countries. The prevalence of PCD ranges from 1:2,200 to 1:40,000, PCD occurring most frequently in families with consanguineous marriages. Evidence suggests that the diagnosis of PCD is often delayed, which is mainly due to a failure to recognize the disease and the need for sophisticated technical resources for PCD screening.( 1 )

In Europe, there are reports of more than 1,000 PCD patients at 223 centers in 26 countries.( 1 ) In the United States, there are reports of fewer than 1,000 patients with an established diagnosis of PCD.( 3 ) In Brazil, most pulmonology clinics lack the resources required for the investigation of PCD; therefore, there are few reported cases,( 4 , 5 ) which are not representative of the prevalence of PCD in the country. According to a European consensus statement, the diagnosis of PCD should be based on the presence of a phenotype consistent with the disease and confirmed by diagnostic tests performed at specialized centers. ( 6 ) Screening tests should precede the diagnostic investigation of PCD.( 6 ) The objective of the present study was to review the literature on the diagnosis of PCD.

Ciliary biology

Cilia are specialized hairlike structures covered by plasma membrane and extending from the cell surface. A cilium contains nine pairs of microtubules in a peripheral, radial distribution, with or without a central pair of microtubules, the microtubular patterns being designated 9+2 and 9+0, respectively. Cilia are classified as motile or nonmotile.( 7 , 8 )

Motile cilia play a role in cell motility and extracellular fluid movement. Motile cilia with a 9+0 arrangement of microtubules are those in notochordal plate cells. During embryonic development (gastrulation), cells in the ventral node contain a single motile cilium per cell. This specialized motile cilium has nine pairs of peripheral microtubules with dynein arms but no central pair of microtubules; its rotational motion contributes to the development of organ laterality during embryogenesis. In the absence of normal nodal ciliary function, organ placement is random. Motile cilia with a 9+2 arrangement of microtubules are those in ciliated airway epithelial cells, fallopian tube epithelial cells, ependymal cells, and sperm tails.

Nonmotile cilia play a role in the perception of extracellular physical and biochemical signals. Nonmotile cilia with a 9+0 arrangement of microtubules are those in renal tubular epithelial cells (monocilia), bile duct epithelial cells, pancreatic duct epithelial cells, chondrocytes, and osteocytes, as well as the connecting cilia in retinal photoreceptor cells. Nonmotile cilia with a 9+2 arrangement of microtubules are those in the inner ear (i.e., kinocilia and stereocilia).

Normal ciliary ultrastructure in ciliated airway epithelial cells

An axial view of a cilium (Figure 1) shows nine peripheral microtubule doublets. Each doublet consists of the A and B tubules. The uniform space between the microtubule doublets is maintained by nexin, which keeps the adjacent microtubules together. In addition, there are the outer and inner dynein arms throughout the A tubule, a central pair of isolated microtubules connected and surrounded by a discontinuous central sheath of protein, and radial spokes, which connect the central microtubules to the peripheral microtubules.

Figure 1.

Schematic illustration and electron micrograph of a normal airway cilium. In A, schematic illustration of an axial section of a normal cilium in a ciliated airway epithelial cell, in which the peripheral microtubular doublets (comprising the A and B tubules) are numbered from 1 to 9; the central microtubules are designated C1 and C2. The A tubule contains the outer and inner dynein arms, which interact dynamically with the B tubule of the adjacent microtubule and produce the sliding of the peripheral microtubular doublets relative to one another. The illustration also shows nexin links, which connect the microtubular doublets (thus preventing structural disarray during their sliding motion), and radial spokes, which extend from the periphery to the center of the ciliary axis. In B, electron micrograph (original magnification, ×50,000) showing the ultrastructural appearance of an axial section of a normal airway cilium. Source: Department of Pathology, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil, 2010.

The outer and inner dynein arms have high, medium, and low molecular weight proteins. The heavy protein chains have ATPase activity and, through ATP hydrolysis, the A tubule slides on the B tubule of each adjacent doublet. The microtubules on the opposite side mediate ciliary bending (a forward power stroke and a backward recovery stroke).( 9 )

Motile ciliated airway epithelial cells are present in the nasal cavity, paranasal sinuses, middle ear, fallopian tube, cervix, vasa deferentia, and ependyma. In the airways, cilia can be found up to the 16th bronchial division. Ciliated respiratory epithelial cells are characterized by long cytoplasmic projections, with approximately 200 cilia per cell. Each cilium is 5-7 μm in length in the trachea and 2-3 μm in length in the seventh airway generation, being 0.25-0.33 μm in diameter.( 10 )

The main function of ciliated airway epithelial cells is to mediate the propulsion of the mucus gel layer toward the head through coordinated movements. In the lungs of healthy individuals, mucus is propelled at a ciliary beat frequency of 12-15 Hz, in the form of waves, at a speed of 4-20 mm/min.( 11 )

Clinical picture

The presence of general clinical indicators (for all age groups) and age-specific indicators should raise the clinical suspicion of PCD.( 12 ) General indicators include situs abnormalities (dextrocardia and isomerism) and a personal or family history of ciliopathies. Age-specific indicators include prenatal indicators (situs abnormalities on ultrasound), neonatal indicators (rhinorrhea at birth, neonatal respiratory distress with no apparent cause in full-term infants, abnormal situs, complex congenital heart disease-especially with laterality disorders-and a family history of PCD), childhood indicators (chronic productive cough, atypical asthma unresponsive to treatment, idiopathic bronchiectasis, rhinosinusitis-the presence of nasal polyposis is rare-agenesis of one or more sinuses, severe otitis media with effusion, prolonged otorrhea after ventilation tube insertion, and having a family member diagnosed with PCD), and adulthood indicators (childhood data plus male infertility due to immotile sperm, ectopic pregnancy, and subfertility due to static cilia in the fallopian tube).( 12 ) In addition to the aforementioned indicators, other authors consider the presence of pectus excavatum, which occurs in approximately 10% of patients with PCD and in 0.3% of the general population, and a high prevalence of scoliosis (5-10%).( 13 )

With regard to ear, nose, and throat problems, approximately 85% of all children with PCD present with severe otitis media with effusion, which usually improves by the age of 13 years. Mucus accumulation in the Eustachian tube causes conductive hearing loss that varies with time. There is also an underdevelopment of the frontal and sphenoid sinuses in PCD patients, and nasal polyposis can occur in up to 18% of cases.( 6 ) More than half of all PCD patients usually have problems in the paranasal sinuses, with frequent radiological investigations and local surgical procedures.( 13 )

Diagnosis

According to a European consensus statement, diagnostic tests should be performed in the following groups: patients with situs inversus or heterotaxy; children with chronic productive cough, idiopathic bronchiectasis, or severe upper airway disease; children with cerebral ventriculomegaly; siblings of patients with PCD; infants with unexplained neonatal respiratory distress; males with immotile sperm; and females with recurrent ectopic pregnancy.( 1 )

Patients should be referred to a specialized center( 6 ) for clinical history taking and screening tests, as well as ciliary function tests (ciliary beat frequency and ciliary beat pattern),( 2 ) ciliary ultrastructural analysis, immunofluorescence, and genetic analysis. In cases of idiopathic bronchiectasis, PCD is a diagnosis of exclusion, given that other causes of bronchiectasis should be ruled out before screening for PCD.( 14 )

The diagnosis of PCD depends on appropriate training and resources. The consensus among American and British researchers is that the PCD phenotype and nasal NO measurements are important; ciliary motion has been studied in greater detail by European researchers,( 15 , 16 ) as has ciliated cell culture. However, American centers for the diagnosis of PCD have reported difficulties in standardizing the interpretation of ciliary motion and electron microscopy. Therefore, at those centers, the diagnosis of PCD is based on the presence of a phenotype consistent with the disease and abnormal nasal NO values, associated with genetic testing to identify the mutations.( 15 )

High-speed video imaging of the ciliary beat frequency and pattern contributes to the understanding of the effects of ciliary defects on mucus transport. It allows the visualization of the normal pattern of ciliary beating; that is, a forward power stroke followed by a slow, slightly sideways, backward recovery stroke. Changes in the normal pattern of ciliary beating can be associated with specific genetic defects.( 16 - 18 ) Chart 1 shows the correlations among reported ciliary ultrastructural defects, gene mutations, and ciliary beat patterns.( 16 ) The most common genetic mutations include the DNAH5 gene mutation (in 15-28% of cases) and the DNAI1 gene mutation (in 2-10% of cases).( 19 )

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Ciliary ultrastructural defects, genetic mutations, and ciliary beat pattern in patients with primary ciliary dyskinesia.

The study of ciliary beat frequency should be accompanied by ciliary beat patterns analysis, given that approximately 10% of individuals with normal ciliary beat frequency can present with an abnormal ciliary beat pattern.( 20 , 21 )

Immunofluorescence assays of cilia collected by nasal brushing, performed with specific antibodies and based on established mutations, can aid in the genetic diagnosis of PCD.( 22 , 23 )

Semen analysis is used in some centers in Brazil as an indirect indicator of PCD, given that sperm cells behave like modified cilia, with reduced motility. However, in patients with Kartagener syndrome, sperm flagella and respiratory cilia vary across individuals and might not be equal in the same patient; this suggests that ciliary and flagellar axonemes( 24 , 25 ) are controlled by common genes and different genes.( 26 ) Therefore, patients with abnormal semen analysis results should be referred to tertiary care facilities for analysis of respiratory cilia, in order to establish a diagnosis.

Definitive diagnosis

In order to establish a definitive diagnosis of PCD, certain phenotypic characteristics (at least three characteristics, typically five or more characteristics) should be present: neonatal respiratory distress in full-term infants; laterality defects; chronic, year-round nasal congestion; chronic, year-round productive cough; recurrent lower respiratory tract infections; bronchiectasis; chronic otitis media with effusion for more than 6 months; chronic pansinusitis; male infertility; and a history of ciliary dyskinesia in a close relative.( 27 )

According to BESTCILIA, a European Commission-funded consortium dedicated to improve PCD care and knowledge,( 23 ) a diagnosis of PCD requires a) a clinical presentation consistent with the disease and b) confirmation by at least two of the following methods: unequivocally abnormal high-speed video microscopy finding; unequivocally abnormal transmission electron microscopy finding; unequivocally abnormal immunofluorescence microscopy finding; abnormally low nasal NO concentration/production; and demonstration of unequivocal biallelic disease-causing mutations by genotyping. In cases in which only high-speed video microscopy and nasal NO concentration/production are abnormal, high-speed video microscopy should be repeated at least three times and show the same abnormal results each time.( 23 ) Patients with typical clinical symptoms and only one abnormal diagnostic test are considered to have a possible diagnosis of PCD, exceptions being made on an individual basis.

At several centers worldwide, the use of nasal NO testing is recommended in order to confirm the diagnosis,( 15 ) and the diagnostic tests should be repeated when the phenotype and low levels of nasal NO do not correlate with ciliary ultrastructure and beat frequency. Secondary defects should be excluded when the results of nasal NO testing are normal and accompanied by ciliary motility defects or ciliary ultrastructural defects.

A genetic test result is considered positive for PCD when there are two genes with trans mutations-in which the wild-type allele (A) and mutant allele (b) of one gene are located on one chromosome and the mutant allele (a) and wild-type allele (B) of another gene are located on the homologous chromosome-and no correcting mutations.( 12 )

Screening tests

Screening tests are important in order to select which of the patients with signs and symptoms suggestive of PCD should undergo analysis of ciliary function and ultrastructure. Nasal NO testing and the saccharin test are used as screening tests in 46% and 36%, respectively, of all centers in 26 European countries.( 2 )

Exhaled nasal NO measurement

Exhaled nasal NO measurement is currently the most recommended screening test.( 28 ) However, the processes of nasal NO production and metabolism in PCD patients have yet to be fully elucidated.( 29 )

The leading hypotheses to explain the reduced nasal NO levels in over 95% of patients with PCD are related to ciliated epithelial cells per se and anatomical obstructions. At the epithelial level, it has been suggested that there is reduced NO biosynthesis or increased NO metabolism caused by the accumulation of thick mucus or the presence of bacteria. At the anatomical level, it has been suggested that NO is sequestered in blocked nasal sinuses or, alternatively, nasal NO biosynthesis or NO storage capacity is limited because of agenesis of the paranasal sinuses.( 29 )

Nasal NO levels are extremely low in PCD patients, for whom nasal NO measurement is strongly recommended.( 30 - 32 ) In the airways, NO plays many roles-it mediates inflammation and stimulates ciliary motility, for example-and NO concentrations are much higher in the upper airways than in the lower airways (200-2,000 ppb vs. 4-160 ppb). Nasal NO production (nL/min) is calculated by multiplying nasal NO concentration by the sampling flow rate. Values of less than 100 nL/min indicate the possibility of PCD.( 27 ) However, values of less than 77 nL/min have a sensitivity of 0.98 and a specificity of more than 0.999 for PCD (in patients over 5 years of age, with the use of palate closure maneuvers and nonmanual chemiluminescence analyzers). ( 32 ) Further studies are needed in order to define cut-off points for tidal volume measurements in uncooperative young children.( 28 , 31 ) Of all PCD-associated gene mutations described to date, the RSPH1 gene mutation is an exception in that patients with that mutation can have normal nasal NO values.( 15 )

The saccharin test

The saccharin test is a good test to assess nasal mucociliary transport, which is usually prolonged in individuals with PCD. It consists of placing a particle of saccharin of 1 mm in diameter on the floor of the nasal cavity, approximately 1 cm into the inferior turbinate. The patient sits quietly with the head bent forward and must not sniff, sneeze, cough, eat, or drink for the duration of the test. The time (in min) to tasting saccharin in the pharynx is measured. The result of the test is considered abnormal when the time to tasting saccharin in the pharynx is greater than 60 min. ( 14 ) However, a study conducted in Brazil( 33 ) and involving 238 children (in the 10-16 year age bracket) established a different cut-off point (of 30 min), showing that the test should not be performed during an acute viral infection or in the subsequent month. In patients with abnormal ciliary ultrastructure, the saccharin test has good sensitivity (95% of cases for values greater than 30 min and 75% of cases for values greater than 60 min). However, false positives can occur in 0.4-15% of cases in healthy adults. Nasal mucociliary transport can be slower in patients with septal deviation or rhinoscleroma. In a recent review,( 6 ) the saccharin test was reported to be difficult to perform correctly and unreliable in children under 12 years of age. In addition, cases with extremely uncoordinated ciliary beating might be missed by the saccharin test.

Pulmonary radioaerosol mucociliary clearance testing

Current clinical experience is insufficient to recommend the use of pulmonary radioaerosol mucociliary clearance tests in clinical practice.( 2 )

Genetics

Genetic studies have identified mutations in several genes encoding ciliary structure and functional proteins; however, genetic tests are not readily available in clinical practice.( 8 ) The finding of a PCD-associated gene mutation constitutes laboratory evidence for a definitive diagnosis of PCD.( 27 ) Chart 1 presents the most important PCD-associated genes described to date. Mutations in genes such as RSPH1, RSPH4A, RSPH9, HYDIN, MCIDAS, and CCNO, which cause no laterality defects, allow clinical correlations to be established.( 3 , 23 )

Associated clinical conditions

There is evidence that ciliary disorders are related to various developmental problems and clinical conditions, which are known as ciliopathies. A family history of ciliopathy should raise the suspicion of PCD in patients or their relatives with characteristics suggestive of PCD. ( 34 ) Nonsyndromic manifestations of ciliopathies typically involve the heart, kidney, liver, retina, and central nervous system, and are characterized by complex congenital heart disease, polycystic kidney disease, nephronophthisis, renal dysplasia, fibrocystic liver disease, retinitis pigmentosa, and hydrocephalus.

Ciliopathies constitute a group of diseases associated( 12 ) with genetic mutations that result in changes in ciliary formation or function. Given that cilia are components of many cell types, ciliary dysfunction can manifest as a constellation of clinical features such as retinal degeneration, kidney disease, and cerebral abnormalities. Molecular genetic studies conducted in recent years suggest a clear relationship between primary cilium development and function and various clinical conditions.( 35 )

Syndromic manifestations of ciliopathies are found in Joubert syndrome, Meckel-Gruber syndrome, Senior-Loken syndrome, oral-facial-digital syndrome, Leber congenital amaurosis, Bardet-Biedl syndrome, Alström syndrome, asphyxiating thoracic dystrophy (Jeune syndrome), Ellis-van Creveld syndrome, and Sensenbrenner syndrome.( 12 )

Kartagener syndrome is a rare congenital malformation consisting of the triad of situs inversus, bronchiectasis, and sinusitis.( 37 ) The association between immotile cilia and situs inversus was based on the hypothesis that, in the early stages of normal embryogenesis, the position of nodal and notochordal cilia and their ciliary beat orientation are predetermined, and that their ciliary beat frequency determines organ laterality through a cascade of molecular signaling. When the aforementioned cilia are immotile, organ placement is random, resulting in many cases of situs inversus, which usually occurs in 50% of PCD patients,( 36 , 37 ) some of whom are diagnosed with Kartagener syndrome.( 38 )

Standardization of electron microscopy analysis of ciliary ultrastructure

Although several transmission electron microscopy facilities have been working on the standardization of diagnostic criteria to be used in ciliary ultrastructural analysis, no proposal has been universally accepted. The variety of PCD-associated defects and the rarity of the disease make it difficult to standardize the interpretation of electron microscopy.( 39 )

There are multiple factors that limit the use of electron microscopy as a diagnostic test for PCD: secondary ciliary changes caused by infection or inflammation; difficulties in the fixation and processing of ciliated cells; the need for ultrathin sections; the technical complexity of transmission electron microscopy; the need for an adequate number of interpretable images; and the fact that interpretation requires recognition of normal variability and nonspecific changes.( 40 ) In addition, samples from children are usually less suitable for ciliary ultrastructural analysis than are those from adults (60% vs. 87%).( 40 , 41 )

Collection of ciliated cells

For ciliated cell collection, nasal brushing has lower morbidity than does nasal biopsy, as well as being less costly and easier to perform. ( 14 , 42 ) Bronchoscopy brushes are used in order to collect ciliated cells from the inferior nasal turbinate, near the transverse septum. Some of the material is separated for ciliary beat frequency and ciliary beat pattern analysis, and the remainder is sent for electron microscopy analysis.( 12 , 14 )

For ciliated cell collection, patients are required to be free of acute respiratory infection for 4-6 weeks in order to minimize the presence of changes caused by secondary dyskinesia.

Parameters for evaluating ciliary ultrastructure

Ciliary orientation

Ciliary disorientation is associated with PCD. In cases of ciliary disorientation, ciliary ultrastructure is normal and ciliary beat frequency is normal or near normal, but ciliary motion is inefficient because of ciliary beat disorientation; that is, it does not correctly propel the mucus.( 42 )

Microtubules

The peripheral microtubules can show disorganization and inner dynein arm defects,( 3 ) as well as transposition defects (the central pair being replaced by a peripheral microtubule).( 43 , 44 )

Transposition defects( 44 , 45 ) or translocation defects( 3 ) are characterized by the absence of the central pair of microtubules in certain cross sections (9+0 arrangement), some sections showing the central pair replaced by an outer microtubule doublet (8+2 arrangement).( 43 , 45 ) The absence of the central pair alone has been reported as a primary defect.( 47 )

Quantification of outer and inner dynein arms is performed in some centers, the standards varying across centers.( 17 , 39 , 43 , 46 , 48 ) Chart 2 summarizes the results of studies involving quantitative assessment of dynein arms.

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Quantitative assessment of dynein arms.

With regard to dynein arm defects, absence of dynein arms can be found in more than 90% of cilia. ( 17 ) Isolated inner dynein arm defects constitute only a small fraction of confirmed PCD cases and require confirmation by repetition of the test with a healthy epithelium sample.( 3 )

Partial absence of dynein as a primary defect is considered controversial and requires further studies for confirmation.( 43 ) Figure 2 shows the major ultrastructural defects described to date.

Figure 2.

Electron micrographs of ciliary ultrastructural defects. In A, absence of outer dynein arms (magnification, ×65,000); in B, microtubular disorganization (magnification: ×30,000); in C, absence of the central pair of microtubules (9+0 arrangement), which is usually associated with the 8+2 transposition defect (magnification: ×65,000); in D, 8+2 transposition defect (magnification: ×65,000). Source: Department of Pathology, University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brazil, 2010.

Normal ciliary ultrastructure and PCD

Extremely reduced nasal NO levels and abnormal ciliary function (ciliary beat frequency, ciliary beat pattern, or both) with normal ciliary ultrastructure require genetic testing for a mutation consistent with the disease (i.e., the DNAH11 gene mutation).( 8 , 27 ) Patients with a clinical history consistent with PCD, low levels of exhaled nasal NO, and abnormal ciliary motility have been diagnosed with PCD, despite the recommendation that genetic testing be performed in order to confirm the diagnosis.( 8 , 27 )

It has been reported that 3-30% of patients with PCD have uncertain or normal ciliary ultrastructure, the diagnosis of PCD in such patients not being based on ciliary ultrastructure alone.( 44 ) Advances in the molecular genetics of PCD have allowed the identification of mutations in approximately 70% of patients.( 15 , 25 )

Dynein arm defects are the most common defects in patients with PCD: outer dynein arm defects, in 30-43% of cases; outer and inner dynein arm defects, in 9-36%; inner dynein arm defects, in 11-30%; normal ultrastructure, in 25%; transposition, in 14%; central pair defects, in 9%; radial spoke defects, in 7%; and ciliary aplasia, in 6%.( 34 )

Rare defects

In patients with PCD, ultrastructural changes include nexin link defects,( 49 ) absence of the central pair of microtubules, and absence of the basal bodies and sheath (alternatively, the basal bodies and sheath are present but have a reduced number of cilia).( 47 , 48 )

Secondary ciliary dyskinesia

Secondary or acquired ciliary dyskinesia can be caused by injury to ciliated airway epithelial cells by physical and chemical agents.

Respiratory infections and the inflammatory immune response to the infections can affect ciliary function, inducing secondary ciliary dyskinesia.

Secondary lesions include compound cilia (fused membranes or multiple axonemes within a single membrane), peripheral and central microtubular abnormalities, swelling of the membranes, shortened dynein arms, ciliary membrane blebs, and absence of the ciliary membrane.( 50 , 51 )

In healthy individuals and in patients without ciliary dyskinesia, there are variations (of 4 ± 3%) in normality for secondary ciliary changes in healthy individuals, and the presence of up to 10% of altered cilia can be considered normal.( 50 , 52 ) In cases of ciliary aplasia, bronchial mucosal biopsy is required in order to confirm the presence of a ciliary defect elsewhere in the airways. Patients with normal ciliary ultrastructure and abnormal ciliary function require ciliary orientation studies.( 14 )

Diagnosis confirmed by ciliated cell culture

Ciliated cell cultures are performed only at specialized centers and are followed by transmission electron microscopy analysis, being recommended to differentiate between primary and secondary defects. Culture duration is approximately 6 weeks. The success rate of ciliated cell cultures is 75%, cultures being conclusive in 85% of cases.( 42 , 43 )

The absence of secondary defects after growth in culture media (ciliogenesis) contributes to the diagnosis of PCD.

Ciliary ultrastructure report and final results

At internationally renowned PCD research centers, the diagnosis (report) of ciliary ultrastructural changes is based on the observation of 200-300 cilia,( 46 ) a minimum of 100 cilia( 44 ) being evaluated in cross sections (and approximately 30% of dynein arms being visualized). Abnormalities found in less than 10% of cilia are considered to be within the normal range.( 50 ) PCD-related defects include absence of outer dynein arms, absence of outer and inner dynein arms, microtubular disorganization,( 43 ) and changes in the central pair of microtubules (transposition defect).( 44 )

The presence of inner dynein arm defects( 3 ) or ciliary disorientation alone requires new samples in order to confirm the diagnosis. The ciliary ultrastructure report should be conclusive regarding the presence or absence of PCD-related defects. The results of all investigations should be expressed as a definitive diagnosis (Chart 3).

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Screening for primary ciliary dyskinesia

Radiology

In patients with PCD, a HRCT scan of the chest (Figure 3) shows middle and lower lobe involvement-the middle and lower lobes being more affected than the upper lobes in PCD patients when compared with cystic fibrosis patients (in whom the upper lobes are more affected than the middle and lower lobes)-with subsegmental atelectasis, peribronchial thickening, mucus plugging, evidence of air trapping, ground-glass opacities,( 25 ) areas of consolidation, and well-defined bronchiectasis.( 19 )

Figure 3.

Axial HRCT scan of the chest of a 30-year-old patient with primary ciliary dyskinesia (absence of outer and inner dynein arms) and advanced lung disease. Note significant involvement of the lung bases, with bronchial wall thickening, the signet ring sign, areas of consolidation, and attenuation differences. Source: Department of Clinical Pulmonology, Heart Institute, University of São Paulo School of Medicine - Hospital das Clínicas, São Paulo, Brazil, 2014.

The presence of bronchiectasis is related to age. In a study of 72 patients, 98% of those over 18 years of age (in the 19-73 year age bracket) had signs and symptoms of bronchiectasis, as did 61% of those under 18 years of age.( 53 ) Adult patients present with advanced lung disease.( 54 )

Pathophysiology of the disease in the airways and lung function

Genetic defects in respiratory epithelial cilia cause a significant reduction in mucociliary transport, with retention of secretions, recurrent infections, and, consequently, bronchiectasis. Impaired alveolar gas exchange can occur in the long term, causing respiratory failure, pulmonary hypertension, and right heart failure.( 52 )

Loss of lung function occurs as a result of undertreatment or delayed diagnosis. There is a relationship between age and loss of lung function, FEV1 decreasing with age. A mean FEV1 drop of 0.8% per year-unrelated to ciliary structural defects-has been reported.( 53 ) However, in a recent longitudinal study of 74 patients, lung function varied widely over the course of 10 years, up to 34% of the patients having experienced a significant decline in lung function despite treatment; this shows that PCD poses a serious threat to lung function.( 55 , 56 )

Treatment

Ciliary defects cannot be treated with the conventional pharmacological armamentarium, and there is no specific treatment for ciliary dysfunction. Therapy is aimed at improving mucociliary clearance, treating infections, and improving or stabilizing lung function, preventing chronic lung injury. The recommendations are based on expert opinion, being inferred from the available evidence for cystic fibrosis, although there are differences between the two diseases in terms of their pathophysiology.( 6 ) Education and information are considered important tools for patients and their families.( 14 )

Outpatient treatment is multidisciplinary, involving pulmonologists, otolaryngologists, nurses, physiotherapists, psychologists, and social workers.( 19 )

Patients should be advised to avoid environmental allergens and smoking, and physical exercise can be a better bronchodilator than beta-agonists. Regular visits to referral centers are to take place every 2-3 months in children and every 6-12 months in adults, as needed.( 14 )

In addition to basic immunization, patients should receive annual influenza vaccination and pneumococcal vaccination.

Respiratory monitoring

The two pillars upon which respiratory treatment stands are antibiotic therapy and chest physiotherapy. Chest physiotherapy should be performed twice a day for 20 min, increasing during exacerbations. ( 14 ) Sputum culture and serial spirometry should be performed in the follow-up of patients with PCD. Antibiotic therapy should be initiated at the first sign of any increase in respiratory symptoms or deterioration of lung function, lasting two weeks in general. Antibiotics should be given on the basis of culture sensitivity testing. Intravenous treatment should be used if symptoms do not respond to oral antibiotics. In adults, colonization with Pseudomonas aeruginosa is not rare and might require more aggressive intravenous therapy and long-term use of inhaled antibiotics.( 2 , 3 , 6 , 23 )

The use of recombinant human DNase, which reduces the viscoelasticity of respiratory mucus, shows conflicting results and requires further investigation before it can be recommended for PCD patients. Hypertonic saline can be effective in improving mucociliary clearance; however, to date, there have been no controlled clinical trials to support its use.( 6 , 23 )

Auditory monitoring

At otolaryngology clinics, patients should be monitored for hearing loss, which requires specific procedures.( 13 ) The results of studies on the treatment of otitis media with effusion are contradictory regarding the use of ventilation tubes, larger samples being required in order to draw conclusions.( 57 ) Endoscopic sinus surgery appears to improve local symptoms.( 13 )

Other referrals

Patients should be counseled about difficulties in conception.( 14 ) In addition, patients with PCD require psychosocial support in order to cope with the stigmata attached to the disease, including infertility and possible school problems.( 14 )

Surgical resection for localized bronchiectasis can be beneficial in some cases.( 58 ) Although lung transplantation is a possibility, only a few cases have been reported in the literature.( 59 )

Prognosis

To date, there have been no large-scale, long-term studies for a more detailed prognosis of PCD. The high genetic variability of the disease determines differences in progression among patients. Pulmonary impairment is more severe in patients diagnosed in adulthood than in those diagnosed in adolescence. A minority of patients might progress to severe lung disease with respiratory failure requiring lung transplantation.( 25 )

Final considerations

The diagnostic report of PCD should include the results of all investigations that led to the diagnosis of the disease, including phenotyping, screening tests, analysis of ciliary function (ciliary beat frequency, ciliary waveform, or both), qualitative and quantitative assessment of ciliary ultrastructure, immunofluorescence, and gene mutation screening. Ciliated cell cultures can aid in the diagnosis of PCD. Normal ciliary ultrastructure does not rule out PCD. The results of all investigations should be expressed as a definitive diagnosis.

"O batimento ciliar foi uma das primeiras características, o Alfa, da vida animal na Terra, e será a última, o Ômega." - J. C. de Man, médico e historiador holandês

Introdução

A discinesia ciliar primária (DCP) é uma doença que se caracteriza por uma alteração da frequência e/ou do padrão de batimento ciliar e que possui uma base genética heterogênea, tipicamente autossômica recessiva; a principal consequência da disfunção ciliar é a baixa eficiência da depuração mucociliar das vias aéreas superiores e inferiores, levando a infecções crônicas e inflamação.( 1 , 2 )

Poucos países apresentam registros da prevalência, do diagnóstico e do prognóstico da doença, com grandes variações entre os dados. A prevalência varia de 1:2.200 a 1:40.000, com maior ocorrência em famílias com casamentos consanguíneos. Evidências sugerem que o diagnóstico é frequentemente tardio, devido principalmente ao não reconhecimento da doença e à necessidade de recursos técnicos sofisticados para a sua investigação.( 1 )

Na Europa, há registros de mais de 1.000 pacientes distribuídos em 223 centros em 26 países.( 1 ) Nos Estados Unidos, há relatos de menos de 1.000 pacientes com um diagnóstico bem estabelecido.( 3 ) No Brasil, a maioria dos serviços de pneumologia carece de recursos para a investigação da DCP, havendo, portanto, poucos casos descritos,( 4 , 5 ) ainda não representativos da prevalência nacional. Segundo consenso europeu, o diagnóstico deve ser baseado na presença do fenótipo e confirmado por meio de testes diagnósticos em centros especializados.( 6 ) Os testes de triagem devem preceder a investigação diagnóstica da DCP.( 6 ) O objetivo deste estudo foi revisar a literatura a respeito do diagnóstico da DCP.

Biologia ciliar

Cílios são estruturas especializadas filiformes, recobertas por membrana plasmática, que se estendem a partir das superfícies celulares. No seu interior, o cílio apresenta nove pares de microtúbulos com distribuição radial periférica, podendo ou não haver mais um par central de microtúbulos, de modo que os arranjos são designados 9+2 ou 9+0, respectivamente. Os cílios são classificados em móveis e não móveis.( 7 , 8 )

Os cílios móveis têm função na motilidade celular e na movimentação de fluidos extracelulares. Os cílios móveis com padrão microtubular 9+0 são os cílios das células nodais da placa notocordal do embrião. Durante o desenvolvimento embriológico (na fase de gástrula do embrião humano), existem células localizadas no polo ou nodo ventral do embrião com um único cílio móvel por célula. Este cílio especializado móvel possui nove pares de microtúbulos periféricos com braços da proteína dineína, mas sem os pares centrais de microtúbulos; seu movimento rotatório determina o desenvolvimento da lateralidade visceral na embriogênese. Na ausência de um funcionamento ciliar nodal normal, a posição dos órgãos será ao acaso. Os cílios móveis com padrão microtubular 9+2 são os cílios das células ciliadas epiteliais das vias aéreas, da tuba uterina, do epêndima e da cauda dos espermatozoides.

Os cílios não móveis têm função de percepção de sinais físicos e bioquímicos extracelulares. Os cílios não móveis com padrão microtubular 9+0 são os cílios das células epiteliais dos túbulos renais (monocílio) e dos ductos biliar e pancreático. São também os cílios dos condrócitos e osteócitos, bem como os cílios conectores das células fotorreceptoras da retina. Os cílios não móveis com padrão microtubular 9+2 são os cílios da orelha interna (quinocílios e estereocílios).

Ultraestrutura do cílio normal no epitélio ciliado das vias aéreas

A estrutura ciliar em corte axial (Figura 1) apresenta nove microtúbulos duplos periféricos. Cada dupla é formada por subfibra A e subfibra B. O espaço uniforme entre os pares de microtúbulos é mantido pela proteína nexina, que mantém unidos os microtúbulos adjacentes entre si. Há também os braços externos e internos da proteína dineína ao longo da subfibra A, um par central de microtúbulos isolados ligados e circundados por uma bainha central descontínua, de natureza proteica, e espículas proteicas radiais, que conectam os microtúbulos centrais aos periféricos.

Figura 1.

Ilustração esquemática e micrografia eletrônica de cílio de via aérea normal. Em A, ilustração esquemática de corte axial de um cílio normal de célula ciliada epitelial das vias aéreas, em que os microtúbulos duplos periféricos aparecem numerados de 1 a 9 (cada qual com sua subfibra A e B); os microtúbulos centrais aparecem designados C1 e C2. Nas subfibras A encontram-se os braços externos e internos de dineína, cuja interação dinâmica com a subfibra B do microtúbulo adjacente promove o deslizamento dos microtúbulos duplos, um sobre o outro. Estão representadas também as pontes de nexina, que unem os microtúbulos duplos, impedindo o desarranjo estrutural durante o deslizamento, e as espículas radiais, dispostas da periferia para o centro do eixo ciliar. Em B, micrografia eletrônica (aumento original: 50.000×) mostrando o aspecto ultraestrutural de um corte axial de cílio normal de via aérea. Fonte: Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo (SP) Brasil, 2010.

Os braços externos e internos de dineína possuem proteínas de alto, médio e baixo peso molecular. As cadeias pesadas de proteína possuem atividade ATPase, que, através da hidrólise da ATP, produzem deslizamento da subfibra A sobre a subfibra B de cada dupla adjacente. Os microtúbulos do lado oposto mediam o encurvamento na direção oposta (batimento efetivo para frente e de recuperação para trás).( 9 )

O epitélio das vias aéreas com células ciliadas móveis ocorre na cavidade nasal, nos seios paranasais, na orelha média, na tuba uterina, no colo uterino, nos ductos deferentes masculinos e no epêndima. Na via aérea, os cílios são encontrados até a 16a divisão brônquica. As células ciliadas do epitélio respiratório são caracterizadas por suas longas projeções citoplasmáticas, com cerca de 200 cílios por célula. Cada cílio tem uma extensão de 5-7 μm na traqueia e de 2-3 μm na sétima geração da via aérea, com diâmetro de 0,25-0,33 μm.( 10 )

A principal função das células ciliadas da via aérea é mediar a propulsão da camada gel de muco em direção cefálica, através de movimentos coordenados. Em pulmões de indivíduos saudáveis, o muco é propelido a uma frequência de batimento de 12-15 Hz, em forma de ondas, a uma velocidade de 4-20 mm/min.( 11 )

Quadro clínico

A presença de indicadores clínicos aplicáveis a todas as idades (indicadores gerais) e de indicadores específicos para cada idade deve levantar a suspeita clínica de DCP.( 12 ) Os indicadores gerais são anormalidades de situs (dextrocardia, isomerismo) e história pessoal ou familiar de ciliopatias. Os indicadores específicos dividem-se em indicadores pré-natais (anormalidades de situs no ultrassom), indicadores neonatais (rinorreia desde o nascimento, desconforto respiratório neonatal sem causa aparente em recém-nascido a termo, situs anormal, doença cardíaca congênita complexa - especialmente com desordens de lateralidade - e antecedentes familiares da doença), indicadores na infância (tosse crônica produtiva, asma atípica não responsiva ao tratamento, bronquiectasia idiopática, rinossinusite - a presença de polipose nasal é rara - agenesia de um ou mais seios, otite média grave com efusão, otorreia prolongada após a inserção de tubos de ventilação e diagnóstico em outro membro da família) e indicadores na vida adulta (os dados da infância com o acréscimo de infertilidade masculina em virtude de imobilidade espermática, gravidez ectópica e subfertilidade em virtude de cílios estáticos na tuba uterina).( 12 ) Outros autores acrescentam aos dados anteriores a presença de pectus excavatum, que ocorre em aproximadamente 10% dos pacientes com DCP e em 0,3% da população geral, e uma alta prevalência de escoliose (5-10%).( 3 )

Quanto aos problemas otorrinolaringológicos, aproximadamente 85% das crianças com DCP apresentam otite média grave com efusão, que costuma melhorar até a idade de 13 anos. O acúmulo de muco na tuba auditiva causa perda condutiva de audição que varia com o tempo. Há ainda um subdesenvolvimento dos seios frontal e esfenoidal nesses pacientes, e a polipose nasal pode ocorrer em até 18% dos casos.( 6 ) Mais da metade dos pacientes costuma ter problemas nos seios paranasais, com investigações radiológicas frequentes e cirurgias locais.( 13 )

Diagnóstico

Uma declaração de consenso entre serviços europeus orienta que sejam realizados testes diagnósticos nos seguintes grupos: pacientes com situs inversus ou heterotaxia; crianças com tosse produtiva crônica ou bronquiectasia de causa desconhecida ou morbidade grave da via aérea superior; crianças com ventriculomegalia cerebral; irmãos de pacientes; recém-nascidos com desconforto respiratório inexplicado; homens com imobilidade espermática e mulheres com gravidez ectópica.( 1 )

Os pacientes devem ser encaminhados para um centro especializado,( 6 ) em que se analisa a história clínica e se realizam os testes de triagem, os testes específicos de função (batimento ciliar e padrão de onda),( 2 ) a análise da ultraestrutura, a imunofluorescência e a análise genética. Nos casos de bronquiectasia de causa desconhecida, a DCP é um diagnóstico de exclusão, visto que, para a sua investigação, outras causas de bronquiectasia devem ter sido afastadas.( 14 )

O diagnóstico depende de recursos e treinamento adequado nos centros. É consenso entre americanos e britânicos que o fenótipo e o teste do óxido nítrico (NO) nasal são importantes; o movimento ciliar é estudado com mais detalhes por europeus,( 15 , 16 ) assim como o é a cultura de cílios. Contudo, centros americanos de diagnóstico de DCP referem dificuldades em padronizar a interpretação do movimento ciliar e da microscopia eletrônica. Priorizam, portanto, para o diagnóstico da doença, a constatação do fenótipo com o teste do NO nasal alterado, associando-o a testes genéticos para a identificação das mutações.( 15 )

Os padrões de batimento ciliar, gravados em vídeos de alta velocidade, possibilitam o entendimento das consequências dos defeitos ciliares no transporte de muco. Por meio desses vídeos, é possível visualizar o padrão normal de batimento ciliar, ou seja, um movimento efetivo para frente, seguido de um movimento lento de recuperação para trás, com leve desvio do eixo. Alterações do padrão normal de batimento podem ser associadas com defeitos genéticos específicos. ( 16 - 18 ) O Quadro 1 mostra a correlação entre defeitos na ultraestrutura ciliar, mutações genéticas e padrões de batimento ciliar relatados. ( 16 ) As mutações genéticas mais frequentemente diagnosticadas até o momento são a do gene DNAH5 (em 15-28% dos casos) e a do gene DNAI1 (em 2-10% dos casos).( 19 )

O estudo da frequência de batimento ciliar deve ser acompanhado pela análise do padrão ou formato de onda, pois cerca de 10% dos casos de frequência de batimento ciliar normal podem ter alteração em seu padrão de onda.( 20 , 21 )

Testes de imunofluorescência, em cílios coletados por escovados nasais, com anticorpos específicos, segundo mutações estabelecidas, propiciam ainda um auxílio para o diagnóstico genético da doença.( 22 , 23 )

Quanto ao espermograma, esse é aceito em alguns serviços nacionais como um indicador indireto do diagnóstico, em virtude de o espermatozoide se comportar como um cílio modificado, com motilidade reduzida. Apresenta, contudo, a crítica de que os flagelos dos espermatozoides e os cílios respiratórios dos pacientes com síndrome de Kartagener variam entre os indivíduos e podem não ser iguais num mesmo paciente, o que sugere que os axonemas dos cílios e flagelos( 24 , 25 ) devem ser controlados por genes comuns e genes diferentes. ( 26 ) Portanto, pacientes com espermograma alterado devem ser encaminhados a serviços terciários para estudo do cílio respiratório, a fim de estabelecer o diagnóstico.

Diagnóstico definitivo

Para que se estabeleça o diagnóstico definitivo de DCP, devem estar presentes certas características fenotípicas (no mínimo três, tipicamente cinco ou mais): desconforto respiratório neonatal em recém-nascidos a termo, defeitos de lateralidade, congestão nasal crônica o ano todo, tosse produtiva o ano todo, infecções recorrentes do trato respiratório inferior, bronquiectasia, otite média crônica com efusão maior de 6 meses, pansinusite crônica, infertilidade masculina e história de discinesia ciliar em familiar próximo.( 27 )

Em uma recomendação recente de um consórcio financiado pela Comissão Europeia denominado BESTCILIA,( 23 ) com o intuito de melhorar o conhecimento e o tratamento da doença, deve-se considerar para o diagnóstico: a) a apresentação clínica consistente com a doença; e b) a confirmação diagnóstica por, no mínimo, dois dos seguintes métodos - a certeza do movimento ciliar alterado em vídeos de alta velocidade, a certeza de alteração na ultraestrutura ciliar, a certeza de alteração em testes de imunofluorescência (anticorpos marcados para cílios, segundo mutações estabelecidas), a demonstração de anormalidades na concentração/produção do NO nasal e a certeza do encontro de mutação genética (em dois alelos) relacionada à doença. Nos casos em que apenas o movimento e o teste do NO nasal estiverem alterados, deve-se repetir o teste de movimento ciliar por até três vezes para comprovar sua alteração. ( 23 ) Pacientes com sintomas clínicos e apenas um teste diagnóstico alterado são considerados como portadores possíveis da doença, com mais exceções.

A utilização do teste do NO nasal é recomendada para a certeza diagnóstica por vários serviços,( 15 ) sendo que a não correlação de fenótipo e baixos níveis de NO nasal com a ultraestrutura e a frequência de batimento ciliar implica a repetição dos testes diagnósticos. Defeitos secundários devem ser excluídos quando o teste do NO nasal for normal e acompanhado por defeitos da motilidade ciliar ou da ultraestrutura.

O teste genético positivo para a doença implica a presença de dois genes com mutações em arranjo trans, no qual um alelo selvagem (A) e um alelo mutante do outro gene (b) se situam em um cromossomo, enquanto o alelo mutante (a) e o alelo selvagem de outro gene (B) se situam no homólogo correspondente, assim como a ausência de mutações corretoras de defeito.( 12 )

Testes de triagem

Os testes de triagem são importantes para a seleção dos pacientes que, dentre aqueles com sinais e sintomas que sugerem a presença de DCP, devem ser submetidos ao estudo da função e ultraestrutura ciliar. Quanto ao acesso aos testes de triagem para a DCP, foi constatado que, em 26 países europeus, 46% dos centros utilizavam o NO nasal e 36% utilizavam o teste da sacarina como testes de triagem.( 2 )

Medida do NO nasal exalado

A medida do NO nasal exalado é atualmente o teste de triagem mais recomendado.( 28 ) No entanto, os processos de produção e de metabolismo do NO nasal na DCP ainda não foram totalmente elucidados.( 29 )

As principais hipóteses para explicar a diminuição do NO nasal em mais de 95% dos pacientes com DCP estão relacionadas com a célula ciliada propriamente dita e com bloqueios anatômicos locais. Ao nível epitelial, haveria uma redução da biossíntese de NO ou um aumento de seu metabolismo provocado pelo acúmulo de muco espesso ou pela presença de bactérias. Ao nível anatômico, o NO seria sequestrado em seios nasais obstruídos ou teria sua biossíntese e estoque prejudicados por agenesias dos seios paranasais.( 29 )

Os resultados do teste são extremamente baixos para pacientes com DCP, com recomendações expressas para a mensuração do NO nasal.( 30 - 32 ) Na via aérea, o NO exerce muitas funções, tais como mediação da inflamação e estimulação da motilidade ciliar, sendo que suas concentrações na via aérea superior (de 200 a 2.000 ppb) são muito maiores que na via aérea inferior (de 4 a 160 ppb). Para calcular o resultado final do teste, multiplica-se a concentração do NO nasal exalado pela taxa de fluxo da amostra coletada (nl/min). Valores menores que 100 nl/min indicam a possibilidade de DCP.( 27 ) Contudo, valores menores que 77 nl/min apresentam sensibilidade de 0,98 e especificidade maior que 0,999 para DCP( 32 ) (em pacientes com mais de 5 anos de idade, com manobras de fechamento do palato e analisadores não manuais, baseados em quimioluminescência). São necessários maiores estudos para definir pontos de corte em mensurações do volume corrente de crianças pequenas, não cooperativas. ( 28 , 31 ) Das mutações genéticas até o momento relacionadas com a doença, a mutação RSPH1 pode apresentar valores normais no teste.( 15 )

Teste da sacarina

O teste da sacarina é um bom teste para avaliar o transporte mucociliar nasal, que é geralmente prolongado na DCP. Consiste na colocação de uma partícula de sacarina de 1 mm de diâmetro no assoalho da fossa nasal, cerca de 1 cm para dentro do corneto inferior. O paciente deve se manter quieto, com a cabeça recurvada para frente. Não pode tossir, espirrar, cheirar, comer ou beber durante o teste. Mede-se o tempo decorrido (em min) desde a colocação da sacarina até o início da sensação de gosto doce na faringe. O resultado do teste é alterado em adultos quando o tempo transcorrido for maior que 60 min. ( 14 ) Contudo, um estudo brasileiro( 33 ) com 238 crianças (de 10-16 anos de idade) determinou um ponto de corte diferente, de 30 min, não devendo ser o teste realizado durante infecção viral aguda nem no mês subsequente ao episódio agudo. O teste apresenta ainda boa sensibilidade para pacientes com ultraestrutura ciliar alterada (95% dos casos com valores maiores que 30 min e 75% dos casos com valores maiores que 60 min). Falsos positivos, contudo, podem ocorrer em 0,4-15% dos casos em adultos saudáveis. O transporte mucociliar nasal pode ainda ser mais lento em pacientes com desvio de septo ou rinoescleroma. Em uma revisão recente,( 6 ) o teste da sacarina foi considerado difícil de ser realizado corretamente e não confiável em menores de 12 anos. Pacientes com cílios muito incoordenados também podem não ser detectados pelo teste.

Medição da depuração mucociliar por radioaerossol

As experiências clínicas são insuficientes para recomendar a medição da depuração mucociliar por radioaerossol na prática.(2)

Genética

Estudos genéticos têm identificado mutações em vários genes que codificam a estrutura e proteínas funcionais do cílio, mas tais testes são pouco disponíveis na prática.( 8 ) O achado de mutação genética relacionada é evidência laboratorial para o diagnóstico definitivo de DCP.( 27 ) O Quadro 1 detalha os mais importantes genes até agora relacionados com a doença. Mutações como as dos genes RSPH1, RSPH4A, RSPH9, HYDIN, MCIDAS e CCNO, que não causam defeitos de lateralidade, permitem correlações clínicas.( 3 , 23 )

Condições clínicas associadas

Há evidências de que as desordens ciliares estão relacionadas com diversos problemas de desenvolvimento e condições clínicas, que são denominadas ciliopatias. Se existir uma história familiar de ciliopatia, uma suspeita diagnóstica deve estar presente para aquele paciente ou membros familiares com possíveis características de DCP.( 34 ) As manifestações não sindrômicas de ciliopatias envolvem tipicamente o coração, o rim, o fígado, a retina e o sistema nervoso central e se caracterizam por doença cardíaca congênita complexa, doença policística renal, nefronoftise, displasia renal, doença fibrocística hepática, retinite pigmentosa e hidrocefalia.

Ciliopatias constituem um grupo de doenças associadas( 12 ) com mutações genéticas que resultam em alterações na formação ou na função dos cílios. Como os cílios são componentes de muitos tipos celulares, a disfunção ciliar pode se manifestar na forma de uma constelação de características clínicas como degeneração da retina, doença renal e anomalias cerebrais. Os estudos de genética molecular realizados nos últimos anos sugerem uma clara ligação entre o desenvolvimento e função do cílio primário e várias condições clínicas.( 35 )

As manifestações sindrômicas de ciliopatias estão presentes na síndrome de Joubert, na síndrome de Meckel-Gruber, na síndrome de Senior-Loken, na síndrome orofacial digital, na amaurose congênita de Leber, na síndrome de Bardet-Biedl, na síndrome de Alström, na distrofia torácica asfixiante (síndrome de Jeune), na síndrome de Ellis-van Creveld e na síndrome de Sensenbrenner.( 12 )

A síndrome de Kartagener é uma rara malformação congênita que compreende a tríade situs inversus, bronquiectasia e sinusite. ( 37 ) A associação entre imobilidade ciliar e situs inversus partiu da hipótese de que, nos estágios iniciais da embriogênese normal, os cílios das células nodais e da placa notocordal do embrião possuem uma posição e uma direção de batimento pré-determinada e de que este batimento, por meio de uma cascata de sinalização molecular, determina a lateralidade visceral. Quando esses cílios são imóveis, a simetria corporal passa a ser determinada ao acaso, resultando em muitos casos de situs inversus, que costuma ocorrer em 50% dos pacientes com DCP,( 36 , 37 ) alguns dos quais são diagnosticados com a síndrome de Kartagener.( 38 )

Padronização da avaliação ciliar por meio de microscopia eletrônica

Serviços diferentes de microscopia eletrônica de transmissão vêm trabalhando na padronização dos critérios diagnósticos para a avaliação ciliar, porém nenhuma proposta tem sido universalmente aceita. A variedade de defeitos descritos associados à DCP e a raridade da doença tornam difícil a padronização da interpretação da microscopia eletrônica.( 39 )

Há múltiplos fatores que limitam o uso da microscopia eletrônica como teste diagnóstico de DCP: o dano ciliar secundário causado pela infecção ou inflamação; as dificuldades na fixação e processamento das células ciliadas; a necessidade de cortes ultrafinos; a complexidade técnica do uso do microscópio eletrônico de transmissão; um número suficiente de amostras para a interpretação e o fato de que a interpretação da microscopia eletrônica requer o conhecimento da variabilidade normal e das alterações que não são específicas.( 40 ) Além disso, amostras provenientes de crianças costumam ser menos adequadas do que as provenientes de adultos (60% vs. 87%) para análise ciliar.( 40 , 41 )

Coleta de cílios

A técnica da escovação nasal para a coleta de células ciliadas tem menor morbidade e custo e é de fácil realização quando comparada à biópsia nasal.( 14 , 42 ) Para tanto, são utilizadas escovas de broncoscopia para a coleta de células ciliadas na concha inferior nasal, próximo ao septo transverso. Parte do material é separada para avaliação da frequência de batimento ciliar e padrão da onda de muco, sendo a parte restante enviada para análise por meio de microscopia eletrônica.( 12 , 14 )

Os pacientes devem estar livres de infecção respiratória aguda há 4-6 semanas no momento da coleta para minimizar a presença de alterações causadas por discinesia secundária.

Parâmetros de avaliação da ultraestrutura ciliar

Orientação ciliar

A desorientação ciliar é também associada à DCP. Em tal situação, o cílio possui um padrão de ultraestrutura normal, com frequência de batimento ciliar normal ou quase normal, porém seu movimento não é eficiente, porque sua direção de batimento não é orientada para a correta propulsão da onda de muco.( 42 )

Microtúbulos

Os microtúbulos periféricos podem apresentar defeitos como desarranjo ou desorganização, associados a defeitos nos braços internos de dineína,( 3 ) bem como defeitos de transposição (substituição de um par central por um microtúbulo periférico).( 43 , 44 )

Os defeitos de transposição( 44 , 45 ) ou translocação( 3 ) são caracterizados pela ausência do par central em alguns cortes transversais (arranjo 9+0), associados com cortes apresentando a substituição do par central por uma dupla de microtúbulos externos em outras secções de corte (arranjo 8+2).( 43 , 45 ) A ausência do par central isoladamente também foi relatada como defeito primário.( 47 )

A quantificação dos braços externos e internos de dineína é realizada em alguns serviços, porém com diferentes padrões.( 17 , 39 , 43 , 46 , 48 ) O Quadro 2 sintetiza estudos em que se realizou a avaliação quantitativa dos braços de dineína.

Quanto à quantificação dos cílios com defeitos nos braços de dineína, a ausência de braços de dineína pode ser verificada em mais de 90% dos cílios.( 17 ) Os defeitos isolados nos braços internos de dineína compreendem uma pequena fração e devem ser confirmados por meio da repetição do teste com uma amostra de epitélio saudável.( 3 )

A ausência parcial de dineína, como defeito primário, é considerada controversa e requer mais estudos para sua confirmação.( 43 ) A Figura 2 mostra os mais importantes defeitos ultraestruturais descritos.

Quadro 1.

Defeitos na ultraestrutura ciliar, mutações genéticas e padrão de batimento ciliar na discinesia ciliar primária.

Ultraestrutura ciliar normal e DCP

A presença de NO nasal muito reduzido e a função ciliar alterada (alteração de frequência de onda, padrão de onda ou de ambos), ambos associados com ultraestrutura ciliar normal, exigem a pesquisa genética de mutação compatível com a doença (isto é, mutação no gene DNAH11).( 8 , 27 ) Pacientes com historia clínica compatível, baixos níveis de NO nasal exalado e motilidade ciliar anormal já receberam diagnóstico de DCP, não obstante a recomendação do estudo genético para a confirmação do diagnóstico.( 8 , 27 )

Há registros ainda de uma alta prevalência (de 3-30%) de DCP com ultraestrutura normal ou incerta, cujo diagnóstico não se baseou na ultraestrutura apenas.( 44 ) Os avanços na genética molecular da DCP têm mostrado que aproximadamente 70% das mutações podem ser identificadas.( 15 , 25 )

Dentre os defeitos encontrados, defeitos dos braços de dineína são os mais comuns: defeitos nos braços externos, em 30-43% dos casos; defeitos nos braços internos e externos, em 9-36%; defeitos nos braços internos, em 11-30%; ultraestrutura normal, em 25%; transposição, em 14%; defeitos no par central, em 9%; defeitos nas espículas radiais, em 7%; e aplasia ciliar, em 6%.( 34 )

Defeitos raros

Alterações ultraestruturais da DCP incluem ainda defeitos nas ligações de nexina,( 49 ) ausência dos microtúbulos centrais e bainha e corpos basais ausentes ou com redução do número de cílios.( 47 , 48 )

Discinesia ciliar secundária

A discinesia ciliar secundária ou adquirida pode ser causada por agressão aos cílios das vias aéreas, em decorrência de insultos variados por agentes físicos e químicos.

Infecções respiratórias e a resposta imune inflamatória às infecções podem alterar a função ciliar, induzindo discinesia ciliar secundária.

Dentre as lesões secundárias relatadas estão os cílios compostos (fusão das membranas ou aumento do número de axonemas em uma membrana), as anormalidades nas tubulopatias periféricas e centrais, edema das membranas, braços de dineína encurtados, bolhas na membrana e ausência da membrana ciliar.( 50 , 51 )

Em indivíduos saudáveis e em pacientes sem discinesia ciliar, há variações de normalidade de alterações ciliares secundárias de 4 ± 3% para os indivíduos saudáveis, sendo que até 10% de cílios fora do padrão podem ser considerados normais.( 50 , 52 ) A aplasia ciliar exige biópsia em mucosa brônquica para a confirmação de defeito ciliar em outro local da via aérea. Os pacientes com ultraestrutura ciliar normal e função ciliar alterada necessitam de estudo de orientação dos cílios.( 14 )

Confirmação diagnóstica por meio de cultura de cílios

Realizada apenas em centros especializados, a cultura de cílios, com posterior análise por meio de microscopia eletrônica de transmissão, está indicada para diferenciar o defeito primário do secundário. O tempo de cultura é de cerca de 6 semanas. A taxa de sucesso da cultura de cílios é de 75%, e a cultura é conclusiva em 85% dos casos.( 42 , 43 )

A ausência de defeitos secundários, após crescimento em meios de cultura (ciliogênese), é um auxílio para o diagnóstico de DCP.

Relatório da ultraestrutura e resultados finais

Serviços com tradição internacional no estudo da DCP baseiam o diagnóstico (laudo) de alteração ultraestrutural na verificação de 200-300 cílios,( 46 ) com um mínimo de 100 cílios( 44 ) avaliados em cortes transversais (e com aproximadamente 30% de braços de dineína visualizados). Anormalidades encontradas em menos de 10% dos cílios são consideradas dentro de uma faixa de normalidade. ( 50 ) Os defeitos relacionados com DCP incluem ausência de braços externos de dineína, ausência de braços externos e internos de dineína, desarranjo dos microtúbulos( 43 ) e alterações no par central com transposição.( 44 )

Os defeitos isolados de braços internos( 3 ) e de desorientação ciliar exigem novas amostras para a confirmação do diagnóstico. O relatório da ultraestrutura deve ser conclusivo quanto à presença ou à ausência de defeitos relacionados com a DCP. Os resultados de todas as investigações devem ser expressos em forma de diagnóstico definitivo (Quadro 3).

Radiologia

A TCAR de tórax (Figura 3) demonstra um maior comprometimento dos lobos médio e inferiores (em contraste com os lobos superiores que são mais afetados na fibrose cística), com destaque para atelectasias subsegmentares, espessamentos peribrônquicos, rolhas de muco, evidências de represamento de ar, opacidades em vidro fosco,( 25 ) áreas de consolidação e bronquiectasias bem definidas.( 19 )

Quadro 2.

Avaliação quantitativa dos braços de dineína.

A presença de bronquiectasia está relacionada à idade. Em casuística de 72 pacientes, 98% dos pacientes com mais de 18 anos (19-73 anos) apresentavam sinais e sintomas de bronquiectasia contra 61% dos pacientes com menos de 18 anos.( 53 ) Os pacientes adultos apresentam doença pulmonar com comprometimento avançado.( 54 )

Fisiopatologia da doença nas vias aéreas e na função pulmonar

O defeito genético do cílio respiratório causa uma redução importante do transporte mucociliar, com retenção de secreções, infecções de repetição e, consequentemente, bronquiectasias. Em longo prazo, pode ocorrer comprometimento da troca gasosa alveolar, causando insuficiência respiratória, hipertensão pulmonar e insuficiência cardíaca direita.( 52 )

A perda de função pulmonar ocorre em razão do subtratamento ou diagnóstico tardio, existindo uma relação entre idade e perda de função, com o VEF1 declinando com a idade. Há registro de perda média de VEF1 de 0,8% por ano (dado não relacionado com o defeito estrutural na DCP). ( 53 ) Contudo, em recente estudo longitudinal de 74 pacientes, houve grande variação da função pulmonar ao longo de 10 anos, com até 34% dos pacientes apresentando declínio importante da função pulmonar a despeito de tratamento, o que emite um alerta de gravidade.( 55 , 56 )

Tratamento

Os defeitos ciliares não são tratáveis com o arsenal farmacológico convencional, e não há tratamento específico para corrigir a disfunção ciliar. A terapêutica busca melhorar a depuração mucociliar, tratar as infecções e melhorar ou estabilizar a função pulmonar, impedindo dano pulmonar crônico. As recomendações baseiam-se na opinião de especialistas, inferidas a partir das evidências disponíveis para a fibrose cística, embora existam diferenças na fisiopatologia das duas doenças.( 6 ) A educação e a informação dos pacientes e familiares são consideradas ferramentas importantes.( 14 )

O tratamento ambulatorial é multidisciplinar, envolvendo pneumologistas, otorrinolaringologistas, enfermeiras, fisioterapeutas, psicólogos e assistentes sociais.( 19 )

Os pacientes devem ser aconselhados a evitar alérgenos ambientais e fumo, e o exercício físico pode ser um melhor broncodilatador que o uso de beta-agonistas. A consulta em centros de referência pode ser feita a cada 2 ou 3 meses em crianças e a cada 6 ou 12 meses em adultos, dependendo da necessidade.( 14 )

Além da imunização básica, os pacientes devem receber a vacina anual contra influenza e a vacina pneumocócica.

Monitorização respiratória

Os dois pilares do tratamento respiratório são a antibioticoterapia e a fisioterapia respiratória. A fisioterapia respiratória deve ser realizada duas vezes ao dia em sessões de 20 min cada e deve ser aumentada nas exacerbações.( 14 ) Cultura de escarro e espirometria seriada devem ser realizadas no acompanhamento de pacientes com DCP. Ao primeiro sinal do aumento dos sintomas respiratórios ou deterioração da função pulmonar, deve ser iniciada a antibioticoterapia, cuja duração é geralmente de duas semanas. Os antibióticos devem ser indicados conforme a sensibilidade das culturas. O tratamento intravenoso deve ser realizado se os sintomas não cederem com a antibioticoterapia oral. Em adultos, a colonização por Pseudomonas aeruginosa não é rara e pode requerer terapia intravenosa mais agressiva e uso de antibióticos inalatórios em longo prazo.( 2 , 3 , 6 , 23 )

O uso de DNase humana recombinante, que reduz a viscoelasticidade do muco respiratório, apresenta resultados conflitantes e requer mais estudos para a sua prescrição na DCP. A solução salina hipertônica pode ser eficaz em melhorar a depuração mucociliar, porém não há, até o momento, ensaios terapêuticos controlados que justifiquem seu uso.( 6 , 23 )

Monitorização auditiva

Serviços de otorrinolaringologia devem acompanhar perdas auditivas, que exigem condutas específicas.( 13 ) Os resultados de estudos sobre o tratamento da otite média com efusão são contraditórios quanto ao uso de tubos de ventilação, necessitando de maior casuística para conclusões.( 57 ) Cirurgias endoscópicas dos seios nasais parecem melhorar a sintomatologia local.( 13 )

Outros encaminhamentos

Os pacientes devem ser orientados quanto a dificuldades para a concepção.( 14 ) Além disso, é necessário apoio psicossocial para o estigma que acompanha a doença, tais como a infertilidade e possíveis problemas escolares.( 14 )

Há casos em que a ressecção cirúrgica da bronquiectasia localizada pode ser benéfica para o paciente.( 58 ) Há também a possibilidade de transplante, porém há poucos casos descritos na literatura.( 59 )

Prognóstico

Não há ainda grandes estudos de longo prazo para um prognóstico mais detalhado dos pacientes com DCP. A doença apresenta uma grande variabilidade genética, que determina evoluções diferentes. Pacientes diagnosticados na vida adulta apresentam maior comprometimento pulmonar que os pacientes diagnosticados na adolescência. Uma minoria de pacientes pode progredir para doença pulmonar grave, com insuficiência respiratória e possível necessidade de transplante pulmonar.( 25 )

Considerações finais

No relatório diagnóstico da DCP, devem ser descritos os resultados das investigações que propiciaram o diagnóstico da doença, isto é, o fenótipo, o teste de triagem, a função ciliar (frequência de batimento ciliar, padrão de onda ou ambos), a análise qualitativa e quantitativa da ultraestrutura ciliar, a imunofluorescência ou a pesquisa de mutação genética. Culturas dos cílios também podem ser usadas como auxílio diagnóstico. A ultraestrutura ciliar normal não exclui o diagnóstico de DCP. Os resultados de todas as investigações devem ser expressos em forma de diagnóstico definitivo.