Characteristics of an outpatient chronic hepatitis B virus infection cohort.

OBJECTIVE: To characterize a chronic hepatitis B cohort based on initial and follow-up clinical evaluations.
METHODS: A retrospective and descriptive analysis of clinical and laboratory data from chronic HBsAg adult carriers, without HIV, unexposed to treatment, with at least two outpatient visits, between February 2006 and November 2012. Fisher´s exact test, χ², Wilcoxon, Spearman, multiple comparisons and Kappa tests were applied, the level of significance adopted was 5%, with a 95% confidence interval.
RESULTS: 175 patients with mean age of 42.95±12.53 years were included: 93 (53.1%) were men, 152 (86.9%) were negative for hepatitis B e-antigen (HBeAg), 3 (1.7%) had hepatitis C coinfection, 15 (8.6%) had cirrhosis, and 2 (1.1%) had hepatocellular carcinoma. Genotype A predominated. Sixty-six patients (37.7%) had active hepatitis, 6 (3.4%) presented immune tolerance, and 38 (21.7%) were inactive carriers. Exacerbations and/or viral breakthrough were detected in 16 patients (9.1%). In 32 patients (18.3%), hepatitis B virus DNA remained persistently elevated and alanine aminotransferase levels were normal, whereas in 17 (9.7%), there was low hepatitis B virus DNA and alterated alanine aminotransferase. If only initial alanine aminotransferase and hepatitis B virus DNA values were considered, 15 cases of active hepatitis would not have been detected. Advanced fibrosis was more common in HBeAg-positive patients, and it was significantly associated with transaminases, hepatitis B virus DNA, and age.
CONCLUSION: Many patients had active hepatitis, but almost 25%, who were HBeAg non-reactive, were only identified because of combined analyses of the hepatitis B virus DNA and transaminases levels, sometimes associated with histological data, after clinical follow-up.

INTRODUCTION

The World Health Organization estimates the existence of approximately 240 million people infected by the hepatitis B (HBV) virus in the world, and approximately 780 thousand annual deaths resulting from the infection.( In Brazil, in 2010, 104,454 cases were confirmed, with a detection rate of 7.6 per 100 thousand inhabitants, which means a low to moderate incidence of the infection in the country.(

The natural history of chronic hepatitis B is characterized by four phases, not necessarily sequential or present in all cases. The initial phase, immune tolerance, is marked by reactivity of “e” antigen (HBeAg), high serum levels of HBV deoxyribonucleic acid (DNA) (HBV-DNA), normal or slightly elevated alanine aminotransferase (ALT), and habitually absence of histological signs of fibrosis and inflammation.( The second phase, immune clearance, results from the attempt to eliminate the virus; its prolonged stay increases the risk of progression to cirrhosis and hepatocelular carcinoma (HCC). There is liver inflammation, ALT elevation, and a modest reduction of the levels of HBV-DNA, culminating in the loss of the HBeAg and seroconversion into anti-HBe.( Next is the phase of the inactive carrier, with remission of the disease, improved prognosis, and usually, improved histology. ALT levels normalize and the HBV-DNA drops (<10 thousand copies/mL or 2,000UI/mL) or becomes undetectable.( However, the fourth phase may appear, with reactivation, whether spontaneous or as a result of immunosuppression, with a progression of liver damage and a new elevation of ALT and HBV-DNA.(

The identification of these phases helps in the prediction of the presence of liver damage, but in practical terms, this is a complex issue due to the dynamic character of the infection.( There are few recent Brazilian studies focused on identifying the presentation forms of chronic hepatitis B, especially those that consider the follow-up of patients with successive HBV-DNA quantifications.(

OBJECTIVE

To determine and characterize the forms of presentation of an outpatient cohort of chronic hepatitis B as per initial and follow-up parameters.

METHODS

Study design and study population

A retrospective cohort study carried out at the Infectious Diseases outpatient clinic of the Universidade Federal de São Paulo. The data were collected by review of medical records of patients admitted between February 2006 and December 2011, with follow-up until November 2012.

Patients monoinfected by HBV or coinfected by HBV and the hepatitis C virus (HCV) were screened. Included were those HBsAg-reagent for more than 6 months, at least two outpatient visits with two collections of biochemical and molecular biology tests, a minimal follow-up of 5 months, more than 18 years of age, and with no HIV infection. Excluded were patients exposed to treatment, only one result available of ALT or HBV-DNA, and absence of a complete serum profile. The Research Ethics Committee of the Universidade Federal de São Paulo approved the study (approval number450,995andCertificate of Presentation for Ethical Appreciation – CAAE: 23237413.5.0000.5505).

Data collection

The following data were collected: age, comorbidities, alcohol consumption, coinfection with HCV, transaminases, serology, HBV-DNA, genotype, liver biopsy result, and presence of clinical cirrhosis, characterized by means of signs and symptoms, laboratory and/or imaging alterations resulting from fibrosis and/or liver failure. For this, the following topics were considered: presence of ascites, encephalopathy, and other conditions, such as telangiectasia, palmar erythema, rarefication of hair in men, jaundice, gynecomastia, flapping, hyperbilirubinemia, hypoalbuminemia, and increased prothrombin time of activity, considering the total clinical picture. Moreover, presence of esophageal and/or gastric fundus varicose veins, splenomegaly, increased portal vein caliber, hepatic echotexture and morphological changes revealing a nodular parenchyma with blunt edge, with or without volume reduction. Whenever the biopsy was available, data was collected as per the METAVIR scoring system for histology activity staging, considering A0 for absent activity, A1 for mild activity, A2 for moderate and A3 for severe; and for fibrosis, considering F0 as the absence of fibrosis, F1 for portal fibrous expansion with no septa, F2 for fibrous expansion with rare septa, F3 for fibrous expansion with numerous septa, and F4 for cirrhosis.

Quantification of the HBV-DNA collected at the facility up to January 2012 was performed in-house, with the real-time polymerase chain reaction method (RT-PCR), using a minimal detection limit of 50UI/mL and maximal of 1,000,000UI/mL. Later, the Abbott Real Time HBV kit (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, United States) was used, with quantification linearity of 15 to 500,000,000UI/mL. Some patients had external tests expressed in copies/mL, and the conversion factor used for transformation into UI/mL was division by 5.2. For the purposes of statistical analysis, results inferior to the detection limit were expressed as zero and those above it as 11,000,000 or 7.04 log. The transaminase values considered altered were those over 30U/mL, both for ALT and for aspartate aminotransferase (AST), based on the local reference values.

Definitions adopted

An inactive carrier was considered when HBeAg nonreactive with normal transaminase levels, HBV-DNA <2,000UI/mL in all measurements, and if a liver biopsy was performed, with histologic activity present or discreet (A0 or A1).(

Immune tolerance was defined in the presence of patients who were HBeAg-reactive, had persistently normal transaminase levels, and HBV-DNA levels over 2,000UI/mL.(

Active hepatitis was considered if ALT was elevated and HBV-DNA was more than 2,000UI/mL in one of two or in most of the observations. If a biopsy was available, the presence of moderate to severe periportal activity (grades 2 and 3 by METAVIR), regardless of the previously cited conditions.(

Viral breakthrough occurred when there were elevated levels of HBV-DNA to more than 2,000UI/mL and at least two times the baseline value.(

Exacerbation was considered when there was an increase greater than five times the baseline levels of transaminases, with any increase of HBV-DNA.(

Statistical analysis

Qualitative variables were expressed as absolute (n) and relative (%) frequencies; the quantitative variables as mean, median, standard deviation, minimum, and maximum. For data analysis, the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) software, version 17, was used. The level of significance adopted was 5%, with a 95% confidence interval.

Fisher's exact test and χ² test were used for isolated qualitative variables; Wilcoxon or Kruskal-Wallis tests for grouped variables. Spearman's test was used to verify the degree of correlation among numeric variables. For statistical differentiation between groups, multiple comparisons were used. The Kappa test was applied to measure agreement between different methods of classification.

RESULTS

Two hundred and seventy-six patients were screened, and 101 were excluded, 72 of them for having only one HBV-DNA result, 8 for having only one ALT value measured, 20 due to exposure to treatment, and 1 for not having the HBeAg. The baseline characteristics of the 175 patients included are shown on table 1.

Table 1

Primary characteristics of the patients selected for the study

Characteristics		n (%)
Sex
	Male	93 (53.1)
	Female	82 (46.9)
Age (years, mean±SD)		42.95±12.52
HCV coinfection		3 (1.7)
HBeAg-reagent		23 (13.1)
Cirrhosis		15 (8.6)
Hepatocellular carcinoma		2 (1.1)

SD: standard deviation; HCV: hepatitis C virus; HBeAg-reagent: reactivity to the e- antigen.

Among the 170 patients who answered about associated diseases, 115 (67.6%) denied comorbidities and 9 (5.3%) presented with more than one condition. Isolated or associated hypertension was present in 19 (11.2%) cases and diabetes mellitus in 13 (7.6%). Information on the consumption of alcohol was obtained in 169 patients (96.6%), 132 (78.1%) of them denied using alcohol, and 5 (2.9%) reported abusive consumption.

The initial mean for HBV-DNA, expressed in logarithm, was 3.64±2.00 log UI/mL. The baseline median for ALT was 26.00±47.33UI/mL in 173 patients and for AST it was 24.00±20.48UI/mL in 164. Most of the patients (154;88%), presented with detectable initial HBV-DNA; for 100 (57.1%) of them it was more than 2000UI/mL, but there was a greater proportion of normal ALT (103 patients; 59.5%), as per figure 1.

Figure 1

Distribution of patients by categories of baseline alanine aminotransferase (A) and hepatitis B (B) DNA values

The genotype was identified in 64 patients (Figure 2). There was a predominance of A (41 patients; 64.1%), with subgenotype A1 in 40 cases and A2 in 1. Genotype D was detected in 18 cases (28.1%). Genotypes C, E, and F were found in 3 (4.7%), 1 (1.6%), and 1 (1.6%) patients, respectively. When comparing 41 patients with genotype A to 21 with genotype C or D, advanced fibrosis was identified (F3, F4, or clinical cirrhosis) in 2.4% of the former and in 14.3% of the latter, with no statistical significance (p=0.1085).

Figure 2

Distribution of the viral genotypes

Ninety-six patients were submitted to liver biopsies (54.9%). Moderate or advanced degrees of histologic activity (A2 and A3) were detected in 39 (40.6%) of them. Fibrosis staging was available in 93 patients, among whom 56 (62.2%) presented with at least F1, and 11 (11.8%) had advanced stages (F3 and F4).

Patients with advanced fibrosis were, on average, 10 years older than the others (50.89±11.64 versus 41.98±12.31 years; p=0.005) and presented with higher baseline levels of HBV-DNA (mean of 5.05±2.3 log versus 3.47±1.9 log; p=0.0009), ALT (median of 44±76.82 versus 25±42.26; p=0.0002) and AST (median of 45.50±13.77 versus 23.00±20.44; p<0.0001). There was also an association between advanced fibrosis and HBeAg-reagents (p=0.027).

By means of Spearman's correlation test, the intensity of association between baseline HBV-DNA and ALT was measured. There was a positive correlation (r=0.44; p<0.0001), with a moderate degree (correlation intensity − r, between 0.3 and 0.7) among these variables.

Individualized analysis of the serum profile, of the set of measurements of HBV DNA/ALT, and of the histology data, whenever available, allowed the determination of the stages of the natural history of chronic hepatitis B in 110 patients (62.9%). Six (3.4%) presented with immune tolerance; 16 (9.1%) with immune clearance or active HBeAg-positive hepatitis; 38 (21.7%) were inactive carriers, and 50 (28.6%) with active HBeAg-negative hepatitis (reactivation). In 65 patients (37.1%) it was not possible to identify any of these phases. Therefore, the following forms of presentation were defined: one exacerbation, 15 viral breakthrough (8.6%), 32 (18.3%) patients with elevated HBV-DNA and persistently normal ALT, and 17 (9.7%) with low HBV-DNA and constantly elevated ALT; among these last two types, two patients reported abusive consumption of alcoholic beverages, and two others were diabetic and had hypertension.

If in the analysis of the presentation forms we considered only the baseline values of ALT and HBV-DNA, the agreement with the abovementioned distribution would be high, i.e., 89% by the Kappa test. Nevertheless, 15 cases of active HBeAg-negative hepatitis would be neglected (p<0.0001), as is shown on table 2. Additionally, it would be impossible to predict viral breakthroughs and exacerbations.

Table 2

Comparing the distribution of presentation forms of the disease, as per initial evaluation and after follow-up

Classification	Initial evaluation	Post follow-up evaluation	Agreement* (%)
Inactive carrier	40	38	95.00
Immune tolerance	6	6	100
Active hepatitis HBeAg non- reagent	31	46	67.40
Elevated HBV-DNA and normal ALT	45	32	71.10
Immuneactivation	15	15	100

p<0.0001.

HBeAg: Hepatitis B e antigen; HBV-DNA: DNA of hepatitis B virus; ALT: alanine aminotransferase.

The presentation forms were associated with HBV-DNA and sex, but not with age. The mean HBV-DNA of the 66 patients with active hepatitis (50 in a phase of reactivation and 16 in immune clearance) and of the six immune tolerant was significantly greater than the others, but similar among themselves (4.89 and 5.21, respectively). The male sex was more frequently associated with active hepatitis (49.5% versus 24.4%) and the female gender with elevated HBV-DNA and normal ALT (28.0% versus 9.0%), as is shown on table 3 (p=0.0009).

Table 3

Distribution of presentation form categories relative to sex

Categories	Sex		p value
	Male n (%)	Female n (%)
Active hepatitis	46 (49.5)*	20 (24.4)*
Inactive carrier	15 (16.1)	23 (28.0)
Elevated HBV-DNA, normal ALT	9 (9.7)*	23 (28.0)*	0.0009
Low HBV-DNA, altered ALT	11 (11.8)	6 (7.3)
Exacerbation/viral breakthroughs	10 (10.8)	6 (7.3)
Immune tolerance	2 (2.2)	4 (4.9)
Total	93 (100)	82 (100)

p<0.05 in multiple comparisons (post-hoc).

HBV-DNA: DNA of the hepatitis B virus; ALT: alanine aminotransferase.

Only 23 patients (13.1%) were HBeAg-reagent, with an initial HBV-DNA mean greater than the others (6.14±1.09 log versus 3.26±1.83 log; p<0.0001), greater medians of ALT and AST (ALT: 42.00±53.96U/mL versus 26.00±45.78U/mL; p=0.0013; AST: 38.00±26.94U/mL versus 23.00±18.45U/mL; p=0.0002), as per figure 3, and a similar age mean (42.22 versus 43.06 years; p=0.6779). These also presented with a greater frequency of active hepatitis (69.6% versus 32.9%, p <0.0001) and advanced fibrosis (26.1% versus 8.6%; p=0.027) than HBeAg non-reagent individuals (Table 4).

Figure 3

Boxplot of the initial values of aminotransferase (A) and DNA of the hepatitis B (B) virus as per the presence or absence of HBeAg

Table 4

Distribution of advanced fibrosis prevalence as per the presence of the e-antigen

HBeag +	Advanced fibrosis		p value
	No (n=156) n (%)	Yes (n=19) n (%)
Yes	17 (10.9)	6 (31.6)	0.0027

HBeAg+: positive hepatitis (reactivation).

DISCUSSION

Chronic infection with HBV is a dynamic and complex process of interaction between the virus, the hepatocytes, and the host's immune system.( The variability in forms of presentation of the disease, both individually and collectively, represents a great challenge in patient management and in public health.( Progression of the liver damage occurs primarily during the active hepatitis phase, therefore, in terms of population, it is important to identify the proportion of individuals that are in this stage.

Two large Brazilian studies demonstrated a high proportion of active hepatitis B within the population studied. One of them, conducted in the Southeastern region, found a rate of 57% among 521 patients; the other revealed 43.6% among 3,614 patients from different regions. In the latter, however, information on HBV-DNA was not available in many cases and neither study defined the presentation forms as per evolution parameters.( Such as in these studies, patients with active hepatic disease corresponded to a large portion of our sample (about 40%), with the difference of the classification having been carried out after clinical follow-up. If only initial data regarding ALT and HBV-DNA had been considered, approximately one fourth of these patients would not have been identified.

Just as has been described in literature, male patients more frequently had active hepatitis in our sample.( Contrary to the findings from endemic regions, where vertical transmission or early childhood acquisition predominate,( the mean age of the individuals at different phases of the disease was similar and relatively high, which along with the small percentage of immune tolerant individuals, suggests a predominance of horizontal transmission in the population studied.

The increase in prevalence of HBeAg non-reagents is a worldwide tendency. A review study conducted in the Middle East described 53 to 90% prevalence of this profile.( A Spanish study revealed that 87.8% of 474 patients were HBeAg non- reagent, a proportion described as similar to that of other Mediterranean countries.( A serologic inquiry with Americans from Asian origin showed a 90% prevalence of the profile.( Two Brazilian studies also demonstrated a higher frequency of HBeAg-negative: 84.4% of 521 patients in the Southeast region and 53.4% of 1,448 patients in regional reference centers for liver diseases.( Similarly, there was a predominance of this profile: 87% of the patients in our study.

The greatest proportion found of active hepatitis among HBeAg-reagents was in accordance with the data from non-endemic regions. A Brazilian research project with 521 patients revealed that 72.8% of the HBeAgreagents presented with an immuneactive phase.( An Australian study with 348 patients revealed a negligible proportion of immune tolerant individualss (6%) within a minority of HBeAg-reagent (28%).( On the other hand, a Brazilian study with 3,614 patients from the five geographical regions showed a prevalence 17% higher of active hepatitis in the HBeAg non-reagent. However, in evaluating the result by region, the only one with a higher rate of active disease among the HBeAg non-reactive was the North, which concentrates high endemicity sub-region for chronic hepatitis B.(

It is known that the loss of HBeAg does not necessarily imply an evolution to a state of inactive carrier or improvement of the prognosis, since it may result from viral mutations that impede production of the marker, and after the event, reactivation may appear.( In conformity with literature, the results of our study suggest greater unpredictability of the evolution of HBeAg non-reagent patients. Determination of the presentation forms of the disease was more complex in the presence of this serological profile, and all the divergence found by analysis of the admission and follow-up parameters occurred in this group.

The influence of genotypes on the progression and prognosis of the disease was recently shown. Genotype A is described as the most prevalent in Brazil,( and was also the most frequent in our study. In a previously conducted investigation in the Brazilian Southeastern region, the D genotype was the second most frequent, as well as in our project.( A prior Brazilian study with 53 patients showed no association among genotypes and advanced fibrosis.( In our research, despite the higher percentage of this condition having been related to genotypes C and D when compared to A, the association was not statistically significant – perhaps due to the size of the sample. On the other hand, a prior Brazilian investigation with 139 patients showed an association between advanced fibrosis and genotype A when compared to D, contradicting data in literature that describes the relation of the latter with a less favorable prognosis.( It is worth mentioning the presence of a patient with genotype E, which is extremely rare in our midst.(

In a systematic review, the factors associated with hepatic mortality were male gender and HBV-DNA. The role of viral genotypes, as well as age, HBeAg, and the levels of ALT, was limited and inconsistent.( A prior Brazilian study found an association between advanced fibrosis and age, HBeAg, alcohol consumption, and male sex in the population studied.( In our research, the variables associated with this condition were HBV-DNA, age, HBeAg, and transaminases.

In the Brazilian reality, many centers do not have quick molecular biology testing, and in practical terms, ALT levels are used to predict the presence of viral replication and liver damage in progress. Research done in endemic areas or not have already demonstrated the weak correlation between viral load and transaminases,( and HBV-DNA is absolutely necessary for establishing the existence of viral multiplication. In our study, the correlation between HBV-DNA and transaminases was only moderate.

In the currently available guidelines, the recommendation is that HBV-DNA, ALT, and HBeAg be analyzed together and with great care for the indication of the biopsy and therapy decision making.( The most recent international guides also point out the need for multiple clinical applications, with repeated measurements of transaminases and HBV-DNA for the determination of the phases of the disease and better management of the infected patient.(

Our project consisted of a real life study in which we sought to measure the difference between a local one-time approach and an evolutionary approach to characterize the forms of the disease in patients with chronic hepatitis B. The primary limitations were its retrospective character, the adoption of the same ALT reference value for male and female patients, and the performance of liver biopsy only when clinically indicated. Within this context, our results, corroborated by literature, suggest that due to the dynamism of the chronic infection by HBV, the infected patient should be continuously and carefully evaluated, as per joint analysis of the clinical, serologic, biochemical, molecular biology, and sometimes histologic parameters.

CONCLUSION

A large part of the patients presented with active hepatitis and therefore, would have indication for treatment. However, approximately one fourth of them (all HBeAg non-reagent) were identified only because of the joint analysis of the sequential measurements of the hepatitis B DNA and the transaminases, sometimes along with histology data, after follow-up.

INTRODUÇÃO

A Organização Mundial da Saúde estima a existência de cerca de 240 milhões de pessoas infectadas pelo vírus da hepatite B (HBV) no mundo e aproximadamente 780 mil óbitos anuais decorrentes da infecção.( No Brasil, em 2010, foram confirmados 104.454 casos, com taxa de detecção de 7,6 por 100 mil habitantes, o que remete a uma baixa a moderada incidência da infecção no país.(

A história natural da hepatite B crônica caracteriza-se por quatro fases não necessariamente sequenciais ou existentes em todos os casos. A fase inicial, a imunotolerância, é marcada pela reatividade do antígeno “e” (HBeAg), altos níveis séricos de ácido desoxirribonucleico (DNA) do HBV (HBV-DNA), alanina aminotransferase (ALT) normal ou pouco aumentada, e habitualmente ausência de sinais histológicos de fibrose e inflamação.( A segunda fase, da imunoativação, resulta da tentativa de eliminação do vírus; seu prolongamento aumenta o risco de progressão para cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC). Há inflamação hepática, elevação de ALT e modesta redução dos níveis de HBV-DNA, culminado na perda do HBeAg e soroconversão em anti-HBe.( Segue-se a fase de portador inativo, com remissão da doença, melhora do prognóstico e, usualmente, histológica. Os níveis de ALT normalizam-se e o HBV-DNA torna-se baixo (<10 mil cópias/mL ou 2.000UI/mL) ou indetectável.( Pode sobrevir, entretanto, a quarta fase, de reativação, espontaneamente ou em decorrência de imunodepressão, com progressão do dano hepático e nova elevação de ALT e HBV-DNA.(

A identificação dessas fases auxilia na predição da presença de dano hepático evolutivo, porém, na prática, é uma tarefa complexa, devido ao caráter dinâmico da infecção.( Há poucos estudos brasileiros recentes com enfoque na identificação das formas de apresentação da hepatite B crônica, especialmente os que consideram o seguimento do paciente com sucessivas quantificações do HBV-DNA.(

OBJETIVO

Determinar e caracterizar as formas de apresentação de uma coorte ambulatorial de pacientes com hepatite B crônica, segundo parâmetros iniciais e evolutivos.

MÉTODOS

Desenho do estudo e população estudada

Estudo de coorte retrospectiva realizado no ambulatório de doenças infecciosas da Universidade Federal de São Paulo. Os dados foram coletados por revisão de prontuários de pacientes admitidos entre fevereiro de 2006 e dezembro de 2011, com seguimento até novembro de 2012.

Foram triados pacientes monoinfectados pelo HBV ou coinfectados pelo HBV e vírus da hepatite C (HCV). Foram incluídos aqueles com HBsAg reagente por mais de 6 meses, ao menos duas consultas ambulatoriais com duas coletas de exames bioquímicos e de biologia molecular, seguimento mínimo de 5 meses, idade superior a 18 anos e sem infecção pelo HIV. Foram excluídos pacientes com exposição a tratamento, somente um resultado disponível de ALT ou HBV-DNA, e ausência de perfil sorológico completo. O Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo aprovou o estudo (número do parecer 450.995 e Certificado de Apresentação para Apreciação Ética – CAAE: 23237413.5.0000.5505).

Coleta de dados

Foram coletados os seguintes dados: idade, comorbidades, consumo de álcool, confecção com HCV, transaminases, sorologias, HBV-DNA, genótipo, resultado de biópsia hepática e presença de cirrose clínica, caracterizada por meio de sinais e sintomas, alterações laboratoriais e/ou de imagem decorrentes da fibrose e/ou insuficiência hepáticas. Foram considerados, para tanto: presença de ascite, encefalopatia e outros estigmas, como telangiectasias, eritema palmar, rarefação de pelos em homens, icterícia, ginecomastia, flapping, hiperbilirrubinemia, hipoalbuminemia e tempo de atividade da protrombina aumentado, em vista do quadro clínico geral, além da presença de varizes de esôfago e/ou fun-do gástrico, esplenomegalia, aumento do calibre de veia porta, alterações ecotexturais e morfológicas hepáticas revelando parênquima nodular de bordos rombos, com ou sem redução volumétrica. Quando a biópsia esteve disponível, foram coletados dados segundo o escore de METAVIR de estadiamento de atividade histológica, sendo A0 para ausente, A1 para leve, A2 para moderada e A3 para severa, e de fibrose, sendo F0 para sem fibrose, F1 para expansão fibrosa portal sem septos, F2 para expansão fibrosa com raros septos, F3 para expansão fibrosa com numerosos septos, e F4 para cirrose.

A quantificação do HBV-DNA coletado no serviço até janeiro de 2012 foi feita pelo método de reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR) in house, com limite mínimo de detecção de 50UI/mL e máximo de 1.000.000UI/mL. A partir de então, passou-se a utilizar o Kit Abbott Real Time HBV (Applied Biosystems, Branchburg, NJ, Estados Unidos), com linearidade de quantificação de 15 a 500.000.000UI/mL. Alguns pacientes possuíam exames externos expressos em cópias/mL e o fator de conversão utilizado para a transformação em UI/mL foi a divisão por 5,2. Para fins de análise estatística, os resultados inferiores ao limite de detecção foram expressos como zero, e os acima, como 11.000.000 ou 7,04 log. Os valores de transaminases considerados alterados foram acima de 30U/mL tanto para ALT quanto para aspartato aminotransferase (AST), com base nos valores de referência locais.

Definições adotadas

Portador inativo foi considerado quando paciente HBeAg não reagente com níveis de transaminases normais, HBV-DNA <2.000UI/mL em todas as mensurações e se realizada biópsia hepática, atividade histológica ausente ou discreta (A0 ou A1).(

Imunotolerância ocorreu quando estiveram presentes HBeAg reagente, níveis de transaminases persistentemente normais e níveis de HBV-DNA acima de 2.000UI/mL.(

Hepatite ativa foi considerada se ALT elevada e HBV-DNA acima de 2.000UI/mL estivessem presentes em uma de duas ou na maior parte das observações. Se biópsia estivesse disponível, presença de atividade periportal moderada a severa (graus 2 a 3 de METAVIR), independentemente das condições previamente citadas.(

Escape viral ocorreu quando houve elevação dos níveis de HBV-DNA a valores superiores a 2.000UI/mL e em ao menos duas vezes o valor basal.(

Exacerbação foi considerada quando houve aumento maior que cinco vezes dos níveis basais de transaminases, com qualquer aumento de HBV-DNA.(

Análise estatística

As variáveis qualitativas foram expressas em frequência absoluta (n) e relativa (%); as quantitativas, em média, mediana, desvio padrão, mínimo e máximo. Para análise dos dados, foi utilizado o software Statistical Package for the Social Science (SPSS), versão 17. O nível de significância estatística adotado foi 5% com intervalo de confiança de 95%.

Os testes exato de Fisher e o teste χ² foram utilizados para variáveis qualitativas isoladas; os testes de Wilcoxon ou Kruskal-Wallis, para agrupadas. Empregou-se o teste de Spearman para verificar o grau de correlação entre variáveis numéricas. Para a diferenciação estatística entre grupos, utilizaram-se comparações múltiplas. O teste Kappa foi aplicado para mensurar a concordância entre diferentes métodos de classificação.

RESULTADOS

Foram triados 276 pacientes e excluídos 101, sendo 72 por resultado único do HBV-DNA, 8 por apenas um valor de ALT mensurado, 20 por exposição a tratamento, e 1 por não realização de HBeAg. As características basais dos 175 pacientes incluídos constam na tabela 1.

Tabela 1

Principais características dos pacientes selecionados para o estudo

Características		n (%)
Sexo
	Masculino	93 (53,1)
	Feminino	82 (46,9)
Idade (anos, média±DP)		42,95±12,52
Coinfecção HCV		3 (1,7)
HBeAg reagente		23 (13,1)
Cirrose		15 (8,6)
Carcinoma hepatocelular		2 (1,1)

DP: desvio padrão; HCV: vírus da hepatite C; HBeAg reagente: reatividade do antígeno e.

Dentre os 170 pacientes com interrogatório sobre doenças associadas, 115 (67,6%) negaram comorbidades e 9 (5,3%) apresentaram mais de uma. Hipertensão isolada ou em associação esteve presente em 19 (11,2%) casos e diabetes mellitus em 13 (7,6%). Informação sobre o consumo de álcool foi obtida em 169 pacientes (96,6%), dos quais 132 (78,1%) negaram uso e 5 (2,9%) relataram consumo abusivo.

A média inicial de HBV-DNA, expressa em logaritmo, foi de 3,64±2,00 log UI/mL. A mediana basal de ALT foi de 26,00±47,33U/mL em 173 pacientes e a de AST foi de 24,00±20,48U/mL em 164. A maioria dos pacientes (154; 88%), apresentou HBV-DNA inicial detectável, sendo 100 (57,1%) acima de 2000UI/mL, mas houve maior proporção de ALT normal (103 pacientes; 59,5%), conforme figura 1.

Figura 1

Distribuição dos pacientes por categorias de valores de alanina aminotransferase (A) e DNA do vírus da hepatite B (B) basais

O genótipo foi identificado em 64 pacientes (Figura 2). Houve predomínio do A (41 pacientes; 64,1%), com subgenótipo A1 em 40 casos e A2 em 1. O genótipo D foi detectado em 18 casos (28,1%). Genótipos C, E, e F foram encontrados em 3 (4,7%), 1 (1,6%) e 1 (1,6%) pacientes, respectivamente. Ao comparar os 41 pacientes com genótipo A aos 21 com genótipo C ou D, foi constatada fibrose avançada (F3, F4 ou cirrose clínica) em 2,4% dos primeiros e 14,3% dos últimos, sem significância estatística (p=0,1085).

Figura 2

Distribuição dos genótipos virais

Foram submetidos à biópsia hepática 96 pacientes (54,9%). Graus moderados ou avançados de atividade histológica (A2 e A3) foram detectados em 39 (40,6%) deles. O estadiamento de fibrose estava disponível em 93 pacientes, dentre os quais 56 (62,2%) apresentavam ao menos F1 e 11 (11,8%) possuíam estágios avançados (F3 e F4).

Os pacientes com fibrose avançada tiveram, em média, 10 anos a mais que os demais (50,89±11,64 versus 41,98±12,31 anos; p=0,005) e apresentaram maiores níveis basais de HBV-DNA (média de 5,05±2,3 log versus 3,47±1,9 log; p=0,0009), ALT (mediana de 44±76,82 versus 25±42,26; p=0,0002) e AST (mediana de 45,50±13,77 versus 23,00±20,44; p<0,0001). Também houve associação entre fibrose avançada e HBeAg reagente (p=0,027).

Por meio do teste de correlação de Spearman, mensurou-se a intensidade de associação entre HBV-DNA e ALT basais. Houve correlação positiva (r=0,44; p<0,0001), em grau moderado (intensidade de correlação − r, entre 0,3 e 0,7) entre estas variáveis.

A análise individualizada do perfil sorológico, do conjunto de mensurações de HBV DNA/ALT e dos dados histológicos, quando disponível, permitiu a determinação dos estágios da história natural da hepatite B crônica em 110 pacientes (62,9%). Seis (3,4%) apresentavam imunotolerância; 16 (9,1%), imunoativação ou hepatite ativa HBeAg positivo; 38 (21,7%), estado de portador inativo e 50 (28,6%), hepatite ativa HBeAg negativa (reativação). Em 65 pacientes (37,1%), não foi possível identificar nenhuma dessas fases. Definiram-se, então, as seguintes formas de apresentação: uma exacerbação, 15 escapes virais (8,6%), 32 (18,3%) pacientes com HBV-DNA elevado e ALT persistentemente normal e 17 (9,7%) com HBV-DNA baixo e ALT constantemente elevada; dentre esses últimos, 2 relataram consumo abusivo de bebidas alcoólicas, e 2 outros eram diabéticos e hipertensos.

Se na análise das formas de apresentação considerássemos apenas os valores basais de ALT e HBV-DNA, a concordância com a distribuição supracitada seria alta: 89% pelo teste Kappa. No entanto, 15 casos de hepatite ativa HBeAg negativos seriam neglicenciados (p<0,0001), como demonstrado na tabela 2. Ademais, seria impossível predizer os escapes virais e exacerbações.

Tabela 2

Comparação da distribuição das formas de apresentação da doença, pela avaliação inicial e após seguimento

Classificação	Avaliação inicial	Avaliação pós-segmento	Concordância* (%)
Portador inativo	40	38	95,00
Imunotolerância	6	6	100
Hepatite ativa HBeAg não reagente	31	46	67,40
HBV-DNA elevado e ALT normal	45	32	71,10
Imunoativação	15	15	100

p<0,0001.

HBV-DNA: DNA do vírus da hepatite B; ALT: alanina aminotransferase. HBeAg não reagente: não reagentes para o antígeno e.

As formas de apresentação associaram-se ao HBV-DNA e ao gênero, mas não tiveram relação com a idade. A média de HBV-DNA dos 66 pacientes com hepatite ativa (50 em fase de reativação e 16 em imunoativação) e dos 6 imunotolerantes foi significativamente maior que os demais, porém semelhante entre si (4,89 e 5,21, respectivamente). O sexo masculino foi mais frequentemente associado a hepatite ativa (49,5% versus 24,4%) e o sexo feminino a HBV-DNA elevado e a ALT normal (28,0% versus 9,0%), como apresentado na tabela 3 (p=0,0009).

Tabela 3

Distribuição das categorias de formas de apresentação da doença em relação ao sexo

Categorias	Sexo		Valor de p
	Masculino n (%)	Feminino n (%)
Hepatite ativa	46 (49,5)*	20 (24,4)*
Portador inativo	15 (16,1)	23 (28,0)
HBV-DNA elevado, ALT normal	9 (9,7)*	23 (28,0)*	0,0009
HBV-DNA baixo, ALT alterada	11 (11,8)	6 (7,3)
Exacerbação/escapes virais	10 (10,8)	6 (7,3)
Imunotolerância	2 (2,2)	4 (4,9)
Total	93 (100)	82 (100)

p<0,05 nas comparações múltiplas (post-hoc).

HBV-DNA: DNA do vírus da hepatite B; ALT: alanina aminotransferase.

Apenas 23 pacientes (13,1%) possuíam HBeAg reagente, com média inicial de HBV-DNA maior que os demais (6,14±1,09 log versus 3,26±1,83 log; p<0,0001), maiores medianas de ALT e AST (ALT: 42,00±53,96U/mL versus 26,00±45,78U/mL; p=0,0013; AST: 38,00±26,94U/mL versus 23,00±18,45U/mL; p=0,0002), conforme figura 3, e média similar de idade (42,22 versus 43,06 anos; p=0,6779). Estes apresentaram, ainda, maior frequência de hepatite ativa (69,6% versus 32,9%, p <0,0001) e fibrose avançada (26,1% versus 8,6%; p=0,027) que os HBeAg não reagentes (Tabela 4).

Figura 3

Boxplot dos valores iniciais de aminotransferase (A) e DNA do vírus da hepatite B (B) de acordo com a presença ou ausência do HBeAg

Tabela 4

Distribuição da prevalência de fibrose avançada segundo a presença do antígeno e

HBeag +	Fibrose avançada		Valor de p
	Não (n=156) n (%)	Sim (n=19) n (%)
Sim	17 (10,9)	6 (31,6)	0,0027

HBeAg+: reatividade do antígeno e positivo.

DISCUSSÃO

A infecção crônica pelo HBV é um processo dinâmico e complexo de interação entre o vírus, os hepatócitos e o sistema imune do hospedeiro.( A variabilidade de formas de apresentação da doença, tanto em nível individual quanto coletivo, representa um grande desafio no manejo do paciente e no âmbito da saúde pública.( A progressão do dano hepático ocorre principalmente na fase de hepatite ativa, portanto, em termos populacionais, é importante dimensionar a proporção de indivíduos que se encontra nesse estágio.

Dois grandes estudos brasileiros demonstraram elevada proporção de hepatite B ativa dentre a população estudada. Um deles, conduzido na Região Sudeste, encontrou taxa de 57% dentre 521 pacientes; outro revelou 43,6% dentre 3.614 pacientes de diferentes regiões. No último, entretanto, informações sobre HBV-DNA não estavam disponíveis em muitos casos e ambos os estudos não definiram as formas de apresentação segundo parâmetros evolutivos.( Tal como nesses estudos, os pacientes com doença hepática ativa corresponderam à grande fração da nossa amostra (cerca de 40%), com a diferença de ter sido realizada a classificação após seguimento clínico. Se fossem considerados apenas os dados iniciais de ALT e HBV-DNA, aproximadamente um quarto desses pacientes não seria identificado.

Assim como descrito na literatura, pacientes do sexo masculino tiveram mais frequentemente hepatite ativa na nossa amostra.( Ao contrário dos achados de regiões endêmicas, onde predomina a transmissão vertical ou aquisição precoce na infância,( a média de idade dos indivíduos em diferentes fases da doença foi semelhante e relativamente elevada, o que, aliado ao pequeno percentual de imunotolerantes, sugere predomínio de transmissão horizontal na população estudada.

O aumento da prevalência de HBeAg não reagentes é uma tendência mundial. Em estudo de revisão no Oriente Médio foi descrito 53 a 90% de prevalência desse perfil.( Estudo espanhol revelou que 87,8% de 474 pacientes eram HBeAg não reagentes, proporção descrita como semelhante a de outros países mediterrâneos.( Inquérito sorológico com americanos de origem asiática mostrou prevalência de 90% do perfil.( Dois estudos brasileiros também demonstraram maior frequência de HBeAg negativos: 84,4% de 521 pacientes na Região Sudeste e 53,4% de 1.448 pacientes de centros regionais de referência para doenças hepáticas.( Semelhantemente, houve predomínio desse perfil: 87% dos pacientes em nosso estudo.

A maior proporção encontrada de hepatite ativa dentre HBeAg reagentes esteve de acordo com os dados de regiões não endêmicas. Pesquisa brasileira com 521 pacientes revelou que 72,8% dos HBeAg reagentes apresentavam fase imunoativa.( Um estudo australiano com 348 pacientes revelou ínfima proporção de imunotolerantes (6%) dentre minoria de HBeAg reagentes (28%).( Contrariamente, uma pesquisa brasileira com 3.614 pacientes das cinco regiões geográficas mostrou prevalência 17% maior de hepatite ativa nos HBeAg não reagentes. Porém, ao avaliar o resultado por região, a única com maior índice de doença ativa dentre HBeAg não reativos foi a Norte, que concentra sub-regiões de alta endemicidade para hepatite B crônica.(

Sabe-se que a perda do HBeAg não implica necessariamente na evolução para estado de portador inativo ou melhora do prognóstico, pois pode ser decorrente de mutações virais que impedem a produção do marcador e, após o evento, pode sobrevir a reativação.( Em conformidade com a literatura, os resultados do nosso estudo sugerem maior imprevisibilidade da evolução dos pacientes HBeAg não reagentes. A determinação das formas de apresentação da doença foi mais complexa na presença desse perfil sorológico, e todas as divergências encontradas pela análise dos parâmetros admissionais e de seguimento aconteceram nesse grupo.

Recentemente, tem-se demonstrado a influência dos genótipos na evolução e no prognóstico da doença. O genótipo A é descrito como o mais prevalente no Brasil,( e também foi o mais frequente em nosso estudo. Em pesquisa previamente conduzida na Região Sudeste brasileira, o genótipo D foi o segundo mais frequente, assim como no nosso trabalho.( Estudo brasileiro prévio com 53 pacientes não mostrou associação entre genótipos e fibrose avançada.( Em nossa pesquisa, apesar do percentual maior dessa condição ter sido relacionado aos genótipos C e D em comparação ao A, a associação não foi estatisticamente significativa − talvez por conta do tamanho amostral. Já uma pesquisa brasileira prévia com 139 pacientes revelou associação entre fibrose avançada e genótipo A quando comparado ao D, contrariando os dados de literatura que descrevem a relação desse último com prognóstico menos favorável.( Merece menção a presença de uma paciente com genótipo E, raríssimo em nosso meio.(

Em uma revisão sistemática, os fatores associados à mortalidade hepática foram sexo masculino e HBV-DNA. O papel dos genótipos virais, bem como da idade, do HBeAg e dos níveis de ALT, foi limitado e inconsistente.( Estudo brasileiro prévio encontrou associação de fibrose avançada com idade, HBeAg, consumo de álcool e sexo masculino na população estudada.( Em nossa pesquisa, as variáveis associadas a essa condição foram HBV-DNA, idade, HBeAg e transaminases.

Na realidade brasileira, muitos centros não dispõem da pronta realização de biologia molecular e, na prática, os níveis de ALT são utilizados para predizer a presença de replicação viral e dano hepático em evolução. Pesquisas em áreas endêmicas ou não já demostraram a fraca correlação entre carga viral e transaminases,( sendo o HBV-DNA absolutamente necessário para estabelecer a existência da multiplicação do vírus. Em nosso estudo, a correlação entre HBV-DNA e transaminases foi apenas moderada.

Em guidelines e diretrizes atualmente disponíveis, orienta-se que HBV-DNA, ALT e HBeAg sejam con-junta e cautelosamente analisados para indicação de biópsia e tomada de decisões terapêuticas.( Os guias internacionais mais recentes destacam ainda a necessidade de múltiplas avaliações clínicas, com repetidas mensurações de transaminases e HBV-DNA para a determinação das fases da doença e melhor manejo do paciente infectado.(

Nosso trabalho consistiu em um estudo de vida real em que se buscou mensurar a diferença entre a abordagem pontual e evolutiva para a caracterização das for-mas da doença em pacientes com hepatite B crônica. As principais limitações foram o seu caráter retrospectivo, a adoção do mesmo valor de referência de ALT para pacientes do sexo masculino e feminino, e a realização de biópsia hepática somente quando clinicamente indicada. Nesse contexto, os nossos resultados, corroborados pela literatura, sugerem que, devido ao dinamismo da infecção crônica pelo HBV, o paciente infectado deve ser contínua e cuidadosamente avaliado, segundo análise conjunta dos parâmetros clínicos, sorológicos, bioquímicos, de biologia molecular e, por vezes, histológicos.

CONCLUSÃO

Grande parte dos pacientes apresentou hepatite ativa e, portanto, teria indicação de tratamento. Porém, aproximadamente um quarto deles (todos HBeAg não reagentes) foi identificado somente em função da análise conjunta das mensurações sequenciais de DNA do vírus da hepatite B e transaminases, por vezes aliadas a dados histológicos, após segmento.