[Vascular endothelial injury induced by anti-endothelial cell antibody in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation].

OBJECTIVE: To clarify the role of endothelial cells (ECs) injury induced by anti-endothelial cell antibody (AECA) in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT).
METHODS: Serum immunoglobulin (IgG) from allo-HSCT recipients were purified and incubated with human umbilical vein vascular endothelium (HUVEC) in vitro, then the functional changes and cell apoptosis were tested.
RESULTS: After incubation with AECA positive IgG, soluble adhesion molecules significantly elevated in culture supernatant. When concentration of IgG was 160, 320, and 640 μg/ml, concentrations of soluble intercellular adhesion molecule-1 in supernatant were statistically higher in AECA positive groups [(117.10 ± 12.82) vs (78.17 ± 4.90) pg/ml, (151.30 ± 15.35) vs (89.46 ± 6.02) pg/ml, (239.00 ± 32.53) vs (127.80 ± 13.86) pg/ml, P<0.01)]. When concentration of IgG was 40, 80, 160, 320, and 640 μg/ml, concentrations of soluble vascular cell adhesion molecule-1 in supernatant were also statistically higher in AECA positive groups [(38.51 ± 3.76) vs (24.78 ± 2.59) pg/ml, (61.34 ± 6.99) vs (38.20 ± 3.17) pg/ml, (135.60 ± 24.46) vs (63.73 ± 5.08) pg/ml, (221.30 ± 29.40) vs (112.80 ± 8.91) pg/ml, (420.90 ± 31.70) vs (224.40 ± 20.79) pg/ml, P<0.01]. Clotting activity factors also elevated in culture supernatant after incubation with AECA positive IgG. When concentration of IgG was 80, 160, 320, and 640 μg/ml, concentrations of von Willebrand factor were statistically higher in AECA positive groups [(19.51 ± 0.72) vs (17.17 ± 0.60) ng/ml, P=0.0193; (22.97 ± 1.18) vs (18.27 ± 0.61) ng/ml, (26.40 ± 1.54) vs (19.53 ± 0.70) ng/ml, (34.35 ± 1.60) vs (23.81 ± 0.92) ng/ml, P<0.01]. When concentration of IgG was 320 and 640 μg/ml, concentrations of thrombomodulin were statistically higher in AECA positive groups [(57.50 ± 4.50) vs (40.31 ± 4.39) pg/ml, P=0.0132; (59.18 ± 4.11) vs (38.84 ± 5.16) pg/ml, P<0.01]. However, inflammatory factors (IL-1β, IL-6, IL-8 and ANG2) were not statistically different in AECA positive and negative groups (P>0.05). Moreover, IgG from AECA positive samples did not change the proliferation or cell apoptosis.
CONCLUSION: AECA from allo-HSCT recipients dysregulates ECs' function in vitro, but do not induce apoptosis, which is valuable in the pathophysiology of graft-versus-host disease (GVHD) and other complications after allo-HSCT.

异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）过程中，诸多因素如大剂量放化疗、免疫抑制剂及异体免疫排斥反应等均可损伤血管内皮细胞（EC）[1]，引起细胞表面黏附分子高表达、炎性因子以及凝血活性因子大量释放，介导淋巴细胞黏附并浸润至靶组织，是移植物抗宿主病（GVHD）发生过程中的重要环节[2]–[3]。血清抗内皮细胞抗体（AECA）是一种能特异性结合EC的自身抗体。对自身免疫性疾病的研究显示，AECA可导致EC功能紊乱或凋亡，从而参与这些疾病的发生[4]。近期有学者研究发现AECA会加剧器官移植患者的急性排斥反应并且与AECA诱导的EC凋亡相关[5]。我们的前期研究发现，急性GVHD(aGVHD）患者血清AECA显著升高，并且可以预测慢性GVHD(cGVHD）的发生[6]。我们推测AECA通过介导EC功能紊乱从而参与GVHD的病理机制。为了验证这一推想，我们收集了allo-HSCT后患者的血清并纯化IgG型免疫球蛋白，将后者与人脐静脉内皮细胞（HUVEC）共培养，观察HUVEC的功能变化及细胞增殖、凋亡情况。

对象和方法

1．研究对象：共收集26例allo-HSCT后患者血样，促凝管收集，分离后储存于−20 °C冰箱中。所有患者均签署知情同意书。同时收集12名正常健康志愿者血清标本作为对照。

2．主要试剂：HUVEC细胞系EA.hy926为首都医科大学何秀娟老师惠赠。高糖DMEM培养基、胎牛血清（FBS）及BCA定量试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG购自美国KPL公司；四甲基联苯胺（TMB）购自美国Tiangen公司；HUVEC及EC完全培养基购自美国Allcells公司；IgG型抗体纯化试剂盒及30KD蛋白浓缩柱购自美国Millipore公司；可溶性E-选择素、可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子-1(sVCAM-1）、血管性血友病因子（VWF）、IL-1β、IL-6、IL-8 ELISA检测试剂盒购自联科生物技术有限公司；血栓调节素（TM）、组织因子（TF）及血管生成素2（ANG2）ELISA检测试剂盒购自博士德生物公司；FITC-Annexin V凋亡试剂盒购自美国BD公司；MTT及放线菌素D购自美国Sigma-Aldrich公司；肿瘤坏死因子α（TNF-α）购自美国Peprotech公司。

3．细胞培养：EA.hy926培养基为高糖DMEM+ 10% FBS+ 100 IU/ml青霉素＋100 µg/ml链霉素；HUVEC接种于EC完全培养基中，培养瓶预先用0.25％明胶铺板37 °C过夜。常规置于37 °C、5%CO2培养箱中培养，2~3 d全量换液，待细胞进入对数生长期后用于实验。

4．细胞铺板及固定：EA.hy926消化后按每孔2.0×104/200 µl接种于96孔板中培养36~48 h，待细胞完全融合后使用无血清培养基培养4 h，弃上清，0.1％戊二醛-PBS 4 °C避光固定细胞10 min。1% BSA-PBS洗涤3次后，每孔加2% BSA-PBS 200 µl室温封闭非特异性抗体2 h。PBS洗涤3次，晾干后于−20°C储存备用。

5．细胞酶联免疫吸附（cyto-ELISA）法检测AECA：每孔加100 µl血清（以PBS按1:100稀释），37 °C孵育2 h后用0.1 %Tween-PBS (PBST) 200 µl洗涤3次；每孔加入辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG (1:5 000）100 µl, 37 °C孵育1.5 h。PBST洗涤4次并拍干后每孔加入显色底物TMB 100 µl，室温避光反应20 min。每孔加入1.2 mol/L硫酸100 µl，立即使用酶标仪在波长450 nm处检测吸光度（A）值。所有样品均复孔检测。以健康志愿者血清为对照，对照组A值均值＋2倍标准差为正常上限，待测样品A值均值高于正常上限者定义为阳性，否则定义为阴性。

6．血清IgG型抗体纯化及浓缩：抗体纯化、浓缩按照IgG型抗体纯化试剂盒（美国Millipore公司产品）说明书进行；纯化后使用Western blot法及考马斯亮蓝染色检测抗体纯度，BCA定量试剂盒测定浓度，−20 °C保存。

7．纯化的IgG与HUVEC共培养：以培养到4~6代的HUVEC为靶细胞，每孔2.0×105/2.5 ml接种于6孔板中，分别加入纯化后的IgG，浓度梯度分别为20、40、80、160、320、640 µg/ml，并设阴性对照孔。37 °C、5%CO2培养箱中培养24 h后收集上清分装于1.5 ml EP管中，−20 °C储存待测。

8．双抗体夹心ELISA法检测上清可溶性黏附分子、凝血因子及炎性因子浓度：上清sE-Selectin、sICAM-1、sVCAM-1、VWF、TM、TF、IL-1β、IL-6、IL-8、ANG2浓度按照相关ELISA试剂盒说明书进行。

9．电镜观察细胞超微结构变化：HUVEC培养到第4~6代时收集细胞，按照1.0×105/ml×5 ml接种于T25细胞培养瓶中，分别加入AECA阳性及阴性IgG，终浓度为320 µg/ml。37 °C、5%CO2培养箱中培养24 h后收集细胞，PBS重悬后送检电镜观察超微结构。

10．流式细胞术检测细胞凋亡：取培养到4~6代的HUVEC，按1.0×105/ml×5 ml接种于T25细胞培养瓶中，加入纯化后的IgG，浓度梯度为20、40、80、160、320、640 µg/ml. 37 °C、5%CO2孵箱中培养24 h后收集细胞，PBS洗涤后重悬于染色缓冲液中，调整浓度为1×106/100 µl，加入Annexin V及碘化丙锭（PI）各5 µl，避光孵育15 min，加入400 µl染色缓冲液后上机检测，每份标本分析2×104个细胞。以TNF-α及放线菌素D与HUVEC共培养作为阳性对照，TNF-α 10 ng/ml，放线菌素D 1 µg/ml，相同培养条件下培养10 h后收集细胞。

11． MTT法检测细胞增殖活性：以培养到4~6代的HUVEC为靶细胞，按每孔1.5×105/100 µl接种于96孔板，以培养基为稀释液，分别稀释AECA阳性及阴性的纯化IgG，按每孔100 µl加入96孔板，最终浓度分别为320、640 µg/ml, 37 °C、5%CO2孵箱中培养24 h。每孔加MTT（5 mg/ml）20 µl，培养4 h。2 000 r/min（离心半径18.0 cm）离心20 min，弃上清。每孔加DMSO 150 µl，室温避光振荡10 min，在波长490 nm处检测A值。

12．统计学处理：采用SPSS 17.0软件及GraphPad Prism 5.0进行数据分析。细胞因子浓度用±s表示，组间均值比较采用t检验。P值采用双侧检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

结果

1．上清可溶性黏附分子浓度：共收集11例AECA阳性、15例AECA阴性患者IgG与HUVEC共培养的上清，结果显示，可溶性E选择素（sE-Selectin）浓度随着IgG浓度的升高呈上升趋势，但AECA阳性组与阴性组sE-Selectin浓度差异并无统计学意义（P>0.05，图1A）；sICAM-1浓度随着IgG浓度的升高呈上升趋势，当IgG浓度≥160 µg/ml时，AECA阳性组sICAM-1浓度显著高于阴性组（P< 0.05，图1B）；sVCAM-1浓度随着IgG浓度的升高亦呈上升趋势，当IgG浓度≥40 µg/ml时AECA阳性组sVCAM-1浓度显著高于阴性组（P<0.05，图1C）。

图1

ELISA法检测抗内皮细胞抗体（AECA）阳性或阴性患者IgG与人脐带内皮细胞共培养后上清可溶性黏附分子浓度（*P<0.05）

A：可溶性E选择素（sE-Selectin）；B：可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）；C：可溶性血管细胞黏附分子-1（sVCAM-1）

2．上清凝血活性因子浓度：共收集11例AECA阳性及15例AECA阴性患者IgG与HUVEC共培养上清，结果显示，VWF浓度随着IgG浓度的升高呈上升趋势，当IgG浓度≥80 µg/ml时，AECA阳性组VWF浓度显著高于阴性组（P<0.05，图2A）；而TF浓度与IgG浓度无明显相关性，且AECA阳性组与阴性组TF浓度在IgG各浓度梯度作用下差异无统计学意义（P>0.05，图2B）；与VWF相似，TM浓度随着IgG浓度的升高呈上升趋势，当IgG浓度≥320 µg/ml时，AECA阳性组TM浓度显著高于阴性组（P<0.05，图2C）。

图2

ELISA法检测抗内皮细胞抗体（AECA）阳性或阴性患者IgG与人脐带内皮细胞共培养后上清凝血活性因子浓度（*P<0.05）

A：血管性血友病因子（VWF）；B：组织因子（TF）；C：血栓调节素（TM）

3．上清炎性因子浓度：共收集11例AECA阳性及15例AECA阴性患者IgG与HUVEC共培养上清，结果显示，IL-1β、IL-6、IL-8、ANG2均与IgG浓度无明显相关，在各浓度梯度下，阳性组与阴性组4种炎性因子分泌量差异无统计学意义（P>0.05，图3）。

图3

ELISA法检测抗内皮细胞抗体（AECA）阳性或阴性患者IgG与人脐带内皮细胞共培养后上清炎性因子浓度

A：IL-1β；B：IL-6；C：IL-8；D：血管生成素2（ANG2）

4．细胞超微结构变化：与AECA阳性IgG共培养后观察细胞超微结构发现，HUVEC无明显凋亡，但细胞表面突起减少，内质网高度扩张，分泌物明显增加。

5．与AECA阳性IgG共培养后HUVEC凋亡比例及增殖能力：共采用AECA阳性及阴性患者IgG各8份与HUVEC共培养，结果显示，与AECA阳性IgG共培养后，细胞凋亡比例并不随IgG浓度上升而增加，且在各浓度IgG作用下，AECA阳性组与阴性组细胞凋亡率差异无统计学意义（P>0.05，图4A），提示AECA并不诱导HUVEC凋亡。而阳性对照组细胞凋亡率明显升高（19.1%，图4C）。

图4

流式细胞术检测人脐静脉内皮细胞（HUVEC）凋亡细胞比例

A：IgG 浓度升高时，凋亡细胞比例无明显变化，抗内皮细胞抗体（AECA）阳性组与阴性组差异无统计学意义；B和C：阴性和阳性对照组细胞凋亡流式图

采用11例AECA阳性、12例AECA阴性患者IgG与HUVEC共培养，MTT法检测细胞增殖活性，结果显示，AECA阳性组与阴性组细胞活性差异无统计学意义（P>0.05，图5），提示细胞增殖不受AECA影响。

图5

MTT法检测人脐静脉内皮细胞增殖活性

AECA：抗内皮细胞抗体

讨论

反映EC损伤的指标如黏附分子、凝血活性因子等在GVHD患者血清中显著升高，且与GVHD严重程度相关[7]–[8]。EC损伤后可以募集T细胞浸润至靶组织从而介导了GVHD的发生[9]–[10]。allo-HSCT过程中引起EC损伤的因素主要有大剂量放化疗、钙调蛋白抑制剂、CMV感染以及免疫因素[1],[11]–[12]。allo-HSCT后血清AECA能否引起EC损伤从而参与GVHD的发生尚未见文献报道。我们利用cyto-ELISA法筛选AECA阳性血清，纯化IgG型免疫球蛋白并与HUVEC共培养，检测上清中黏附分子、凝血活性因子、炎性因子的表达以及细胞增殖与凋亡，从而探讨AECA对EC功能的影响。

我们的结果显示，与AECA阳性的IgG共培养后，HUVEC表达的sICAM-1、sVCAM-1显著升高，并呈浓度依赖性。黏附分子是EC募集并介导免疫细胞尤其是T细胞浸润至靶组织的最重要分子。自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮（SLE）、系统性硬化症（SS）等患者血清纯化后的IgG可以显著增强EC高表达黏附分子并促使淋巴细胞与之黏附[13]。Eyrich等[14]发现小鼠aGVHD模型中淋巴细胞表面α整合素、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1）亦有显著升高；作为VCAM-1、ICAM-1的配体，α整合素、LFA-1表达量上升意味着淋巴细胞与活化EC的黏附作用。因此，我们推测AECA可能通过上调EC表达黏附分子参与了GVHD的发生。

allo-HSCT后患者常常伴有出血倾向及凝血功能异常，临床表现为移植相关性微血管病（TAM）、肝静脉闭塞病（VOD）等，这与EC受损后释放的凝血活性因子启动凝血途径有关[15]–[16]。有学者研究发现，Ⅱ～Ⅳ度aGVHD患者体内TF浓度显著高于基础水平，并且经免疫抑制治疗后可回降[17]，提示TF可能参与了GVHD的发生。我们的实验结果显示，与AECA阳性的IgG共培养后，HUVEC分泌的VWF、TM有显著升高，而此前我们也发现部分TAM患者AECA阳性[6]，提示AECA可能通过激活EC分泌的凝血活性因子从而参与了TAM及VOD的发生过程，但我们并未发现TF浓度变化，还需进一步的临床及实验研究加以验证。

众所周知，炎性因子大量释放所致的炎性风暴是aGVHD发生过程中的重要环节。有研究显示，在SLE、SS等疾病模型中，EC在AECA刺激下可以释放IL-1β、IL-6、IL-8、ANG2等[13]；而GVHD患者血清中炎性因子亦显著升高[18]–[19]，这些炎性因子是否由EC受到AECA刺激后释放？我们的研究并未发现AECA可以刺激EC高表达此类炎性因子，可能是GVHD患者体内炎性因子主要由淋巴细胞释放所致，亦可能与我们的培养体系未引入补体有关。

AECA能否引起EC凋亡尚存在争议。在自身免疫性疾病及器官移植免疫学中研究发现，AECA可以诱导EC凋亡，并可能与微血管损伤、排斥反应相关[20]–[21]。但也有研究发现AECA并不能引起EC凋亡[22]。已经证实GVHD患者血浆中游离EC显著升高，并可能与EC凋亡相关[8]，那么EC凋亡是否为AECA引起？我们的研究未发现AECA阳性IgG能诱导EC凋亡；此外，细胞分泌的ANG2无显著升高，也从侧面证实EC未在AECA的作用下启动凋亡程序，提示allo-HSCT后的EC凋亡可能另有原因。

诚然，本实验尚存在一些不足。首先，我们仅研究了AECA与EC的关系。事实上，抗体与细胞间的作用机制还涉及到补体、T淋巴细胞等因素（如ADCC等），因此，本实验不能替代体内错综复杂的病理生理过程。其次，AECA识别EC的靶抗原迄今未有定论，因此无法纯化单克隆性IgG来研究，而总IgG中存在一些非特异性抗体可能干扰实验结果。最后，我们研究的样本量偏少，需扩大样本量、设计更为科学的研究方能深入探讨AECA在GVHD中的具体机制。