[Screening of Highly Expressed CPEΔN Lung Cancer H1299 Cells].

BACKGROUND AND
OBJECTIVE: The N-terminal truncated carboxypeptidase E (CPEΔN) protein is a novel biomarker of tumor metastasis. This study screened the H1299 cell line with a highly expressed CPEΔN gene for in vivo imaging experiment.
METHODS: Human CPEΔN gene was cloned into the luciferase lentiviral vector. H1299 cells transduced with CPEΔN or control lentiviral vectors were selected with 2 µg/mL puromycin. The expression of CPEΔN was identified through Western blot analysis, and luciferase activity was measured using luciferase reporters.
RESULTS: The human CPEΔN lentiviral expression vector was successfully constructed. The transfection rate of H1299 cells by the lentivirus achieved 80%, with an infection multiplicity of 20. The H1299 cell line with high CPEΔN (H1299-CPEΔN) expression was established, with an increase in CPEΔN expression by four times compared with the control lentivirus-transfected H1299 cell line (H1299-control). As H1299-CPEΔN and H1299-control can effectively decompose luciferase substrates, they can be applied in in vivo imaging.
CONCLUSIONS: H1299-CPEΔN and H1299-control can be used in in vivo imaging experiment for further research on molecular mechanisms and signal transduction to elucidate the role of CPEΔN in lung cancer metastasis.

羧肽酶E（carboxypeptidase E, CPE）是一个金属离子依赖的肽链端解酶，它的生物学功能非常多元化。按照亚细胞定位的差异，CPE的功能可以被分为外肽酶功能和非酶功能两类[。第一部分CPE是以分泌形式表达的，这部分CPE主要分布在内分泌及神经内分泌细胞中，他们可以将激素原或神经多肽裂解为成熟的激素或神经肽，进而调节内分泌及神经信号的传导[。第二部分CPE是以非分泌性形式存在的，他们或者结合在细胞质膜上参与高尔基体的转运过程[；或者定位在细胞质、细胞核中参与细胞信号传导、转录调控。这部分CPE蛋白的功能是多元的，也是目前最受关注的。

近年研究者采用信使RNA（messenger RNA, mRNA）芯片技术分析了CPE在不同肿瘤细胞中的表达，结果显示在神经内分泌起源的肿瘤组织如成神经细胞瘤、胶质瘤中CPE的高表达预示肿瘤具有较好的预后[，而在一些非内分泌的肿瘤如乳腺癌、肾细胞癌、宫颈癌中[，CPE的高表达常常预示着患者的生存期短、预后差。在不同起源的肿瘤组织中CPE的功能是矛盾的且不明朗。2011年香港大学Lee的一项研究给我们带来了新的启示，他们在肝细胞癌中发现一种截短形式的CPE蛋白即CPE△N，他可以作为一个独立性指标，预测肝癌和嗜铬细胞瘤的转移和复发[。CPE△N能够与组蛋白去乙酰化酶1和组蛋白去乙酰化酶2结合进而抑制转移相关蛋白NEDD9的表达。

2013年周坤等[在结直肠癌中也发现了CPE△N的表达，并且证实在肿瘤组织中只有截短形式的CPE△N表达，CPE△N高表达的病例复发、转移率高于CPE△N低表达病例。肝细胞癌、嗜硌细胞瘤、结肠癌是起源不同的三种肿瘤类型，CPE△N高表达可以预测三者的复发，提示CPE△N很可能是一个广谱的肿瘤预测分子。

在本研究室的前期工作中，我们在9个肺癌细胞株中检测到CPE△N的表达，并且证实CPE△N的表达可以加速肺癌细胞浸润转移。为进一步明确CPE△N促进肺癌转移的易发部位，并揭示其可能分子机制，本研究选取CPE△N蛋白表达量最少的肺癌细胞株H1299作为母细胞，筛选得到了共表达荧光素酶和CPEΔN的H1299肺癌细胞株，并证实CPEΔN高表达细胞株和对照细胞株均可以有效分解荧光素酶底物，可以用于后期的小鼠活体成像实验，现将结果报道如下。

材料和方法

材料

慢病毒载体pCMV-GFP-LV、pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro和慢病毒包装试剂盒购自上海禾元生物；高保真酶、胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生物；限制性内切酶、T4连接酶来自美国NEB公司；SYBR Premix EX Taq试剂盒购自TaKaRa，感受态细胞DH5α购自TaKaRa；H1299细胞购自上海细胞库；DMEM培养基、胎牛血清和青、链霉素购自天根生物；转染试剂脂质体2000购自Invitrogen，嘌呤霉素（Puromycin）购自翊圣公司，双荧光报告基因检测试剂盒购自Promega。

方法

确定慢病毒载体对H1299细胞的转染效率

将H1299细胞接种到24孔板中，细胞数为1×104/孔。约16 h后，用带荧光标记的慢病毒载体pCMV-GFP-LV转染H1299。病毒量按如下公式计算：细胞数×感染倍数（multiple of infection, MOI）值/病毒原液滴度×103=病毒加药量。本研究的MOI值共设计了5个梯度，分别是MOI 10、MOI 20、MOI 40、MOI 80和MOI 100。完成转染后加入puromycin，使其终浓度为5 μg/mL，20 h后更换为新鲜培养基。72 h后荧光显微镜拍照，确定最佳感染条件。

构建CPEΔN慢病毒表达载体

CPEΔN正向引物为CGAGCTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGAGGCG GCGCCGGCG（含同源重组序列、kozak序列、EcoR I酶切位点和目的基因5’端配对序列）；反向引物为：TCATCCTTGTAGTCGGATCCAAAATTTAAAGT TTCTGACATCAT（含同源重组序列、BamH I酶切位点，目的基因3’端配对序列）。扩增CPEΔN基因后，用EcoR I和BamH I酶切处理，之后与相同酶切处理的pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro载体进行同源重组，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选阳性克隆，之后酶切鉴定并验证表达。

筛选H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株

将H1299细胞接种到24孔板中，细胞数为1×104/孔，细胞汇合度约30%；16 h后分别转染CPEΔN慢病毒表达载体或慢病毒空载体，MOI值取20，Puromycin终浓度为5 μg/mL，24 h后换液，弃去培养基每孔加入500 μL的新鲜培养基。72 h以后，加入含2 μg/mL puromycin的新鲜培养基。每隔2-3天换液1次，药物筛选约14 d。获得高表达CPEΔN和对照慢病毒载体的H1299肺癌细胞系（分别命名为H1299-CPEΔN和H1299-control）。通过Real-time PCR和Western blot分析CPEΔN的表达，并冻存H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株。

荧光素酶报告基因检测

按照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明，裂解H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株，检测二者分解荧光素酶底物的活性。

结果

慢病毒载体可以高效感染H1299肺癌细胞

为了分析慢病毒载体对H1299细胞的感染效率、优化感染条件，本研究选择了一个带绿色荧光蛋白，并且转染效率和pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro相同的慢病毒载体pCMV-GFP-LV作为研究对象。设计了MOI 10、MOI 20、MOI 40、MOI 80、MOI 100共5个病毒转染梯度，结果显示当MOI 20、MOI 40、MOI 60、MOI 80、MOI 100时感染效率都达到80%以上（图 1）。本着高效、低毒的原则，选择MOI 20作为后续病毒感染的最佳条件。

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分析不同MOI条件下，慢病毒载体对H1299细胞的转染效率

The transfection efficiency of lentiviral vector in H1299 cells at different multiple of infection (MOI)

分析CPEΔN蛋白的表达并确定其对荧光素酶底物的分解活性

通过菌落PCR和酶切鉴定，证实pLenti-CMV-MCS-HA-3Flag-P2A-LUC-T2A-Puro-CPEΔN慢病毒表达载体构建成功（图 2A）。加入嘌呤霉素加压筛选14 d后，获得了H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株。通过Western blot和Real-time PCR检测两个细胞株中CPEΔN的表达。结果如图 2B所示，二个细胞系中CPEΔN蛋白表达量约为4:1（凝胶灰度扫描结果），CPEΔN mRNA的比值约为2:1。

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CPEΔN表达载体的构建及鉴定。A：左图：菌落PCR鉴定重组CPEΔN表达载体。阴性对照（第1道），阳性对照（第2道），挑取8个菌落克隆进行菌落PCR鉴定（3道-10道）；右图：酶切鉴定重组CPEΔN表达载体；B：Western blot和Real-time PCR分析CPEΔN蛋白在CPEΔN高过表达细胞系和对照H1299细胞系中的表达；C：报告基因检测分析H1299-CPEΔN和H1299-control细胞株中荧光素酶活性。

Construction and identification of human CPEΔN expression vector. A: Left picture, Identification of recombinant CPEΔN expression vectors using colony PCR. Negative control (lane 1), positive control (lane 2), 8 colonies picked for colony-PCR identification (lanes 3-10). Right picture, identification of recombinant CPEΔN expression vectors by restriction enzyme; B: Analysis of CPEΔN expression by Western blot and real-time PCR in H1299-CPEΔN cells and H1299-control cells; C: Luciferase reporter gene assay in H1299-CPEΔN cells and H1299-control cells.

分析两个细胞系对荧光素酶底物的分解作用，每组取1×104个细胞，CPEΔN高表达细胞株的luciferase均值为19, 891, 000，对照慢病毒载体细胞株的luciferase均值为18, 281, 000（图 2C），二者分解荧光素酶底物的能力没有显著差异。提示筛选到的H1299-CPEΔN细胞株在表达CPEΔN的同时，能够有效地分解荧光素酶底物可以用于后续的活体成像实验。

讨论

CPEΔN是2011年被鉴定出来的肿瘤转移相关蛋白。Lee等[证实在所有肝癌病例只表达CPE△N。当癌和癌旁正常组织CPE△N RNA比值> 2，术后2年复发率高达92.8%，中位生存时间为8.6个月；而癌和癌旁CPE△N RNA比值< 2的病例，术后2年复发率只有25.2%，中位生存时间超过90个月，组间差异具有统计学意义。2013年Zhou等[再次证实CPEΔN的高表达可以作为独立性指标预测结直肠癌的预后不良。在这些文献的提示下，本课题组分析了CPEΔN表达与肺腺癌预后的相关性也得到相似结论结果将在另外文章发表。

为了探索CPEΔN过表达，是否像我们预测的那样可以加速肿瘤细胞向脑、肝脏或骨组织这些代谢、增殖旺盛的区域转移，本课题设计了小鼠活体成像实验。为了尽可能地追踪肿瘤细胞去向，去除动物本底干扰，我们选择了一个经过改造的慢病毒表达载体。选择用这个表达载体主要基于3个考虑：①慢病毒载体的转染效率可以达到80%-90%，并且这种基因整合可以随着细胞分裂被传递到子代；②这个载体将目的基因和荧光素酶基因偶联在同一个启动子上，可以实现一个细胞同时表达两种蛋白，不必同时转染两种质粒再用两种抗生素加压筛选，方法学上简单、易行；③小鼠体内不表达荧光素酶，这样可以最大程度的去除本底。通过腹腔内注入荧光素酶底物，在30 min能够清晰显示肿瘤细胞在小鼠体内的分布情况。据报道通过荧光检测技术可以追踪到腹腔种植少量的肿瘤细胞，这个方法很适合观察微小转移灶。

在本研究中，我们没有选取单克隆而是选择了多克隆CPEΔN高表达细胞株。作者认为这种方式可以更直接的体现CPEΔN蛋白过表达赋予细胞的功能改变，而不是某一株单克隆细胞系的个性化行为，并且这种筛选方式可以节约成本，节省时间[。分析荧光素酶报告基因检测结果，可以看到H1299-CPEΔN和H1299-control两个细胞株降解荧光素酶底物的能力没有差异。这个工作的完成将为进一步确证CPEΔN促进肺癌转移提供动物水平佐证。CPEΔN蛋白有希望成为新的肺癌转移预测分子，用于肿瘤的个性化诊断和治疗。