The metagenomic approach and causality in virology.

Nowadays, the metagenomic approach has been a very important tool in the discovery of new viruses in environmental and biological samples. Here we discuss how these discoveries may help to elucidate the etiology of diseases and the criteria necessary to establish a causal association between a virus and a disease.

INTRODUCTION

Before the association between an infectious agent and a disease is made public, it needs to be well established. The adequate treatment of patients suffering from an infectious disease, implementation of preventive measures, understanding of the different phases of the disease, development of therapies, and occasionally, the development of a vaccine depend on the elucidation of this association. The criteria for achieving correct associations are being proposed by eminent scientists. , - , , ,

With regard to viruses, which are the focus here, the need for establishing a causal association is a very contemporary subject because many viruses are now being discovered. Metagenomic techniques and next-generation sequencing platforms are the main drivers of these discoveries. At the same time, several potentially infectious diseases and several cases of common infectious diseases, including acute respiratory disease, encephalitis, acute gastroenteritis, and hepatitis, do not have a known etiological agent. ,

CRITERIA FOR CAUSAL ASSOCIATION BETWEEN AGENTS AND DISEASES

In the end of the 19th century, Koch defended the fundamental principles that helped establish the causal association between microorganisms and infectious diseases according to a set of criteria laid out by him. According to this author, a proof of causality requires the agent to be present in every case of a particular disease, to be absent in other diseases, and after isolation and culture, be sufficient to reproduce the disease by inoculation of a susceptible host.

Since then, some modifications of these postulates have been proposed, including the following: the acknowledgment of viruses as infectious agents (they were unknown in Koch’s time), , of the importance of the study of antibodies (presence and time of appearance), of the possibility of disease prevention using vaccines against the virus, of the importance of epidemiological studies, and of the concept that several factors, and not only a single cause, can contribute to disease development.

Owing to the advances in molecular biology techniques, proposals to amend Koch’s postulates from the 80s onwards included criteria based on microbial genetics. , , Among these recent propositions, both the criteria of Mokili et al, based on the comparison of metagenomic characteristics among infected and healthy individuals, and the criteria of Lipkin, who grouped laboratory, clinical and epidemiological data into three certainty levels to establish an association between pathogens and diseases, considered the inoculation of the infectious agent in a healthy individual as a criterion for the confirmation of causality (this criterion was inherited from Koch’s postulates). However, because of ethical issues, it is not possible to inoculate a suspected pathogen in human beings, and with exceptions such as the SARS-related human coronavirus, few etiological agents have a susceptible experimental animal model. Moreover, Lipkin suggested an alternative to this rule from Koch’s postulates and indicated that a causal association can be confirmed if the disease can be attenuated or prevented with the use of microorganism-specific vaccines, drugs, or antibodies.

On the other hand, according to the molecular guidelines of Fredericks & Relman for establishing microbial disease causation, there is no need to isolate a virus or inoculate it in a host. These guidelines are based on the identification of the microbial genome using in situ hybridization in tissue samples with pathological changes and on the analysis of the copy number of pathogen-associated nucleic acid sequences in tissue samples with or without lesions during several phases of the disease, including the period before disease onset.

Because of the difficulties encountered when applying the postulates of causality, it is accepted that not all criteria listed by authors need to be fulfilled. , - , In case it is impossible to fulfill all the criteria, the evidence accumulated over time and the common sense of researchers will be important to identify the causal agent of a certain disease. , ,

VIRAL METAGENOMICS

The term “metagenomics” indicates a joint analysis of microbial genomes in an environmental sample, not only from the genetic point of view but also in terms of function.

The term “viral metagenomics” involves the detection of the genome of all viruses present in environmental samples (e.g., fresh water lake, reclaimed water), , or biological samples (e.g., respiratory tract aspirates, human and animal feces) , , that could harbor a large diversity of viruses. This term is also used when the metagenomic approach is applied to identify the genome of a virus that can potentially cause a specific disease and/or a cytopathic effect in cell culture, when other common techniques failed to detect the virus. ,

The metagenomic approach includes several steps, as follows: the purification and concentration of the viral particles (or the viral nucleic acid if the virus is found in the latent form or integrated into the host genome), nucleic acid extraction, reverse transcription of RNA to cDNA, random amplification of genomic sequences, sequencing of nucleic acid fragments, and sequence analysis using bioinformatics tools. , , Nucleic acid fragments can be sequenced using the Sanger method after molecular cloning or using next-generation sequencing platforms, which are more sensitive and generate a much larger number of sequences than molecular cloning using a bacterial host. , , ,

DISCOVERY OF VIRUSES THROUGH VIRAL METAGENOMICS

Although the metagenomic approach has been significantly contributing to the tremendous increase in the discovery of viruses, the number of novel associations between viruses and diseases has not been increasing in the same proportion. The causal association depends not only on detecting the presence of a virus in a sick person but also on conducting a complete investigation of the virus-disease association in order to comply with Koch’s postulates or with the criteria of causation proposed later.

The use of the metagenomic approach in environmental samples has enabled the discovery of several novel genomic sequences potentially derived from viruses. However, the data obtained from these genomes are insufficient to identify the hosts and assess the pathogenic potential of the viruses. Cataloging these genomes into public databases is important, so that after further research, it will hopefully be possible to identify the viral hosts.

The need to identify the correct host and the potential pathogenicity of the virus is also imperative when a previously unknown virus is found in fecal samples or upper respiratory tract secretions. The presence of a virus in these samples during the acute phase of the disease does not necessarily make this agent responsible for the pathology. This can be the case when a virus shedded from the host for a prolonged period, e.g., enterovirus and bocavirus, is detected. In addition, a virus detected in fecal samples or respiratory tract secretions may have been inhaled or ingested and may have passed through the lumen of the respiratory or digestive tract without replicating into that host. , The human bocavirus exemplifies the difficulty in evaluating the causal association between a newly discovered virus in the respiratory tract and the clinical manifestations. Bocaviruses were discovered in 2005 using a metagenomic approach in a pool of randomly selected samples of nasopharyngeal aspirates and have been a topic of intense research since then. This research has indicated that the factors that hinder the establishment of a causal association between the virus and disease include the high prevalence of bocavirus infection, prolonged viral shedding by the host after infection, persistence of the viral DNA in the respiratory tract for several months, and high rate of coinfection. The studies conducted to date suggest that bocaviruses are sometimes transient passengers and eventually pathogens of the respiratory tract. ,

Even when the metagenomic approach leads to the detection of a new virus in the cerebrospinal fluid (CSF), which is generally sterile, the disease cannot be associated with the virus before further investigation. This hypothesis can be discussed on the basis of recent findings of Tan et al, who found a new cyclovirus in CSF specimens of two patients with an acute infection of the central nervous system. After its identification, this virus was detected in 4.0% of 642 CSF samples from patients suspected of having an infection of the central nervous system; however, it was not detected in any of the 122 samples from patients with a noninfectious neurologic disease. The viral genome was also found in fecal samples of healthy children, which suggested food-borne or fecal-oral transmission route. In addition, it was found in animal feces, suggesting the existence of animal reservoirs for this virus. These authors affirmed that, considering the current knowledge, it is impossible to establish a causal association between this virus and the disease according to Koch’s criteria or their adapted versions. For further assessment of this association, Tan et al are attempting to isolate the virus in cell cultures or animal models and to detect a specific immune response. This is a justifiable caution because a virus found in CSF can be a coinfectious agent – which would play a secondary role in disease pathology and could increase disease severity or facilitate the entry of other pathogens –, or a latent virus that was reactivated because of an infectious/inflammatory process, or it can simply reflect the detection of a latent virus. , , , This discussion is common in cases of detection in CSF of human herpesviruses that are disseminated through the hematogenous route, such as the Epstein-Barr virus and the human herpesvirus 6. , , The new cyclovirus could also be like the anelloviruses, which establish chronic active infections, may be devoid of pathogenicity (they can be components of the normal human microflora), and can be found in the central nervous system, blood, and several other body fluids.

The viruses can also be detected by metagenomic approaches in chronic diseases; however, the causal association can be even more difficult, as can be observed in a large amount of data on the Merkel cell polyomavirus (MCV). This virus was identified in human Merkel cell carcinoma (MCC) samples, and the investigation of the causal association between MCV and the disease began with the investigation of 10 MCC samples from different patients; of these, the viral genome was detected in eight samples. In 75.0% of these samples, viral DNA was integrated into the tumor genome in a clonal pattern, suggesting that the infection and integration process preceded the clonal expansion of the tumor cells. Control tissue samples tested positive for the MCV genome in expressively lower percentage, and there was evidence that the number of copies of the viral genome in these positive samples was lower than that in the MCC samples. A high incidence of MCV among MCC cases has been confirmed in several countries, except in Australia. It is known that human infection with MCV occurs early, considering that the seroprevalence is 50.0% among individuals aged below 15 years. Studies with RNA interference and on the genetic changes of the viral genome integrated into MCC cells have indicated that MCV may contribute to the onset of MCC.

When a new virus is detected in the blood of a patient with a disease that is probably infectious, only the identification of a new agent is also not proof of its causal relationship with the disease, as can be exemplified by the discovery of a new bunyavirus in China, which was named Henan fever (HNF) virus or severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV). This virus was detected almost simultaneously by two research groups using a metagenomic approach in serum and blood leucocytes; samples were obtained during the acute phase of the disease, which is characterized by fever, thrombocytopenia, and leukopenia. An extensive epidemiological, clinical, and laboratory investigation was conducted along with this discovery. In the laboratory, the evidence for this association included viral isolation, followed by visualization of the viral particles by electron microscopy, detection of the viral genome, and positive serology in patient samples. , The investigation by both research groups also included analysis of the control groups. When discussing the causal association between the HNF virus and the severe fever with thrombocytopenia syndrome, both the groups concluded that, although they could not completely fulfill Koch’s postulates, there was a strong evidence indicative of this association. , The fact that independent researchers confirmed these results , , corroborates this potential association, as stated in Lipkin’s guidelines.

FINAL CONSIDERATIONS

Viral metagenomics has been having a great impact on the discovery of new viruses because it enables the detection of all viral genomes present in a given sample independently from antisera tests, from previous knowledge of the viral genome (unlike other molecular biology techniques such as polymerase chain reaction, microarray, and in situ hybridization), and from cell culture isolation. , ,

However, the causal association between a virus and a disease in humans and other animals still depends on a set of clinical, epidemiological, and laboratory investigations; on the use of strict criteria to associate these elements, such as those in Koch’s postulates and their adapted versions; and on common sense during data analysis. , , , , ,

INTRODUÇÃO

A associação entre um agente infeccioso e uma doença, antes de se tornar pública, deve estar muito bem embasada. Dela depende o tratamento dos pacientes acometidos por essa doença infecciosa, as medidas de prevenção, o estudo e compreensão das diferentes fases da doença, o desenvolvimento de terapêuticas e eventualmente até de vacina. Critérios para que essa associação seja feita corretamente têm sido propostos por eminentes cientistas. , - , , ,

Em relação aos vírus, foco deste comentário, a preocupação em estabelecer essa relação de causalidade é assunto bastante atual, pois estão sendo descobertos muitos vírus recentemente, descobertas estas impulsionadas principalmente devido às técnicas de metagenômica e às plataformas de sequenciamento de nova geração. Ao mesmo tempo, diversas doenças provavelmente infecciosas e grande porcentagem de casos de síndromes infecciosas comuns, como síndromes respiratórias agudas, encefalites, gastroenterites agudas e hepatites, não têm seu agente etiológico conhecido. ,

CRITÉRIOS DE ASSOCIAÇÃO ENTRE AGENTES E DOENÇAS

Koch, ao final do século XIX, defendeu princípios fundamentais para que a correlação entre microrganismos e doenças infecciosas fosse feita de forma criteriosa. Segundo esse autor, uma prova de causalidade necessita que um agente esteja presente em cada caso da doença, não seja encontrado em outras doenças e, após isolamento e cultivo, seja suficiente para reprodução da doença em um hospedeiro susceptível.

Desde então, foram propostos adendos e modificações a esses postulados, como: os vírus foram adicionados como agentes infecciosos, já que à época de Koch eles eram desconhecidos; , foram introduzidas a importância do estudo de anticorpos (presença e época de aparecimento), a possibilidade de prevenção da doença em estudo com a vacina contra o vírus, a importância de estudos epidemiológicos, a concepção de que vários fatores, e não somente uma causa, podem atuar no desenvolvimento de uma doença.

Devido aos avanços das técnicas de biologia molecular, a partir da década de 1980 as sugestões de atualização dos postulados de Koch mostram a inserção de critérios baseados em genética dos microrganismos. , , Entre essas proposições mais recentes, tanto os critérios de Mokili et al baseados na comparação de traços metagenômicos entre indivíduos doentes e indivíduos-controle, quanto os de Lipkin, que agrupou dados laboratoriais e clínico-epidemiológicos em três níveis de certeza para associação de patógenos a doenças, colocaram como critério para confirmação de causalidade a inoculação do agente infeccioso em um indivíduo sadio – critério herdado dos postulados de Koch. No entanto, por questões éticas, não se pode inocular um agente suspeito de causar doença em seres humanos e, com exceções como o coronavírus humano relacionado à SARS, são raros os agentes que têm um modelo animal experimental susceptível a eles. Lipkin sugeriu, além disso, uma alternativa a esse cumprimento dos postulados de Koch, dizendo que uma relação causal pode ser confirmada se a doença puder ser atenuada ou prevenida pelo uso de vacinas, drogas ou anticorpos específicos contra o microrganismo.

Por outro lado, nas diretrizes moleculares para estabelecimento da causa de doenças microbianas de Fredericks & Relman, não consta a necessidade de isolamento do vírus ou de sua inoculação em um hospedeiro. Essas diretrizes baseiam-se na demonstração do genoma microbiano por hibridização in situ em áreas com alteração patológica do tecido e na análise do número de cópias do genoma microbiano em tecidos com e sem lesão e em várias fases da doença, incluindo a avaliação do número de cópias de sequências do patógeno precedendo a doença.

Pelas dificuldades enfrentadas para aplicar os postulados de causalidade, é aceito que nem todos os critérios de um autor necessitem, obrigatoriamente, ser preenchidos. , - , Na impossibilidade de preencher todos os critérios, serão importantes provas acumuladas ao longo do tempo e o bom senso dos pesquisadores para identificar o agente causal daquela doença. , ,

METAGENÔMICA VIRAL

O termo “metagenômica” foi cunhado com o significado de análise do conjunto dos genomas microbianos de uma amostra ambiental, tanto do ponto de vista das sequências quanto das funções.

O termo “metagenômica viral” tem sido utilizado quando o estudo avalia o genoma de todos os vírus existentes em amostras ambientais (e.g., água de lagos, água de reúso) , ou biológicas (e.g., aspirados do trato respiratório, fezes humanas e de outros animais), , , nas quais se pressupõe presença de grande diversidade de vírus, e também quando a abordagem metagenômica é utilizada para a identificação do genoma de um provável vírus responsável por uma doença específica e/ou pelo efeito citopático em cultura de células, se várias técnicas usuais não conseguiram detectá-lo. ,

A abordagem metagenômica viral inclui vários passos: purificação e concentração das partículas virais (ou do ácido nucleico viral, se existir a possibilidade de o vírus estar na forma latente ou integrado ao genoma do hospedeiro); extração de ácidos nucleicos; transcrição reversa de RNA para cDNA; amplificação randômica dos segmentos genômicos; sequenciamento dos fragmentos de ácidos nucleicos e análise das sequências com métodos de bioinformática. , , O sequenciamento desses fragmentos pode ser feito pela técnica de Sanger após clonagem ou em plataformas de sequenciamento de nova geração, que são mais sensíveis e passíveis de gerar quantidade muito maior de sequências em relação à clonagem em hospedeiro bacteriano. , , ,

DESCOBERTA DE VÍRUS ATRAVÉS DA METAGENÔMICA VIRAL

Apesar de a abordagem metagenômica estar contribuindo para o aumento a passos largos do número de vírus descobertos, o número de novas associações de vírus a doenças não tem ocorrido na mesma proporção. A associação causal depende não só do encontro do vírus em um paciente doente, mas da completa investigação da relação vírus-doença, com vistas a preencher os postulados de Koch ou os critérios que a estes se seguiram.

O uso da abordagem metagenômica em amostras ambientais já possibilitou descobertas de inúmeras novas sequências genômicas provavelmente derivadas de vírus. No entanto, somente esses dados dos novos genomas são insuficientes para identificar os hospedeiros e o potencial patogênico dos vírus. A catalogação desses genomas nas bases públicas de dados é importante para que no futuro, com resultados de mais pesquisas, sejam identificados os hospedeiros desses vírus.

Essa necessidade de investigação do verdadeiro hospedeiro e possível patogenicidade do vírus também é imperiosa quando encontramos um vírus, previamente desconhecido, em amostras de fezes e de secreções do trato respiratório superior. A presença do vírus nessas amostras, durante a fase aguda de uma doença, não o torna necessariamente agente responsável pela patologia. Pode ser o caso de detecção de um vírus que tenha excreção prolongada, e.g., enterovírus e bocavírus. Além disso, um vírus detectado em fezes e amostras de secreção de vias respiratórias pode apenas ter sido inalado ou ingerido e ser um passageiro através do lúmen dos dutos do trato respiratório ou digestivo, sem se replicar naquele hospedeiro. , O bocavírus humano exemplifica essa dificuldade em avaliar a associação de um vírus novo descoberto no trato respiratório a um quadro clínico. Descoberto em 2005 por abordagem metagenômica em um pool de amostras selecionadas aleatoriamente de aspirado nasofaríngeo, o bocavírus tem sido alvo de inúmeras pesquisas desde então. Estas identificaram fatores que dificultam a associação do vírus com doença: a prevalência de infecção pelo bocavírus é alta, a excreção viral após a infecção é prolongada, o DNA viral pode permanecer no trato respiratório por vários meses, e a taxa de coinfecção é alta. Até o momento, os resultados das pesquisas sugerem que o bocavírus é ora um passageiro, ora um patógeno em pacientes com doenças do trato respiratório. ,

Mesmo quando a abordagem metagenômica leva à detecção de um novo vírus em líquido cefalorraquidiano (LCR), um ambiente geralmente estéril, não se pode atribuir a doença ao vírus sem outras investigações. Essa afirmação pode ser discutida com base nos achados recentes de Tan et al, que encontraram um novo ciclovírus no LCR de dois pacientes com infecção aguda do sistema nervoso central. Depois da identificação desse novo vírus, Tan et al detectaram-no em 4,0% de 642 amostras de LCR de pacientes com suspeita de infecção do sistema nervoso central e não o detectaram em nenhum dos 122 pacientes com doença neurológica não-infecciosa. O genoma viral também foi encontrado em fezes de crianças sadias, o que sugere uma rota de transmissão fecal-oral ou infecção via alimentos, e em fezes de animais, sugerindo a existência de reservatórios animais para esse vírus. Tan et al afirmaram a impossibilidade, no atual estágio de conhecimento, de associar esse vírus à doença pelos critérios de Koch ou pelas versões adaptadas dos mesmos. Para avançar nessa avaliação de causalidade, Tan et al estão buscando o isolamento do vírus em cultura de células ou modelo animal e a detecção de uma resposta imune específica. Essa cautela é justificável, pois um vírus encontrado no LCR pode ser um agente coinfectante – que teria papel secundário na patologia e que poderia aumentar a gravidade da doença ou facilitar a entrada de outros patógenos –, um vírus que estava latente e foi reativado devido ao processo infeccioso/inflamatório da doença ou ainda simplesmente refletir detecção de um vírus latente. , , , Essa discussão é comum em casos de detecção no LCR de herpesvírus humanos que são disseminados pela via hematogênica, como o Epstein-Barr e o Herpesvírus humano 6. , , Poderiam ainda ser vírus como os anelovírus, que estabelecem infecções produtivas crônicas, talvez não sejam patogênicos (podem ser componentes da microflora humana normal) e podem ser encontrados no sistema nervoso central, no sangue e em vários outros fluidos corpóreos.

Vírus também podem ser detectados por abordagem metagenômica em doenças crônicas, mas a associação de causalidade pode ser ainda mais difícil, como se constata pelos inúmeros dados envolvendo o poliomavírus de célula Merkel (MCV). Identificado em amostras de carcinoma humano de célula Merkel (MCC), a investigação da associação do MCV com essa doença iniciou-se com a pesquisa de dez amostras de MCC de diferentes pacientes, sendo que em oito delas foi detectado o genoma viral. Em 75,0% dessas amostras, o DNA viral estava integrado ao genoma do tumor em um padrão clonal, sugerindo que a infecção e a integração precederam a expansão clonal das células tumorais. Tecidos-controle testados foram positivos para o genoma de MCV em porcentagem expressivamente menor, e houve evidências de que o número de cópias do genoma viral nas amostras positivas também era menor do que nas amostras do MCC. Estudos posteriores confirmaram presença do MCV em alta porcentagem dos casos de MCC em vários países, exceto em pacientes da Austrália. Sabe-se atualmente que a infecção humana com o MCV ocorre cedo, uma vez que a soroprevalência é de 50,0% para pessoas abaixo de 15 anos. Estudos com RNA de interferência e de avaliação das alterações genéticas do genoma viral integrado a células do MCC trouxeram evidências de que o MCV talvez contribua para o desenvolvimento do MCC.

No caso de novo vírus detectado em sangue de paciente com uma síndrome provavelmente infecciosa, somente o encontro de um novo agente também não define a associação com a doença, como pode ser exemplificado pela descoberta de um novo buniavírus na China. Esse novo buniavírus denominado vírus HNF (Henan fever virus) ou SFTSV (Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus) foi detectado quase simultaneamente por dois grupos por abordagem metagenômica em soro ou leucócitos do sangue, obtidos durante a fase aguda de síndrome que cursa com febre, trombocitopenia e leucopenia. Associada a essa descoberta, foi feita extensa pesquisa epidemiológica, clínica e laboratorial. No laboratório, as linhas de evidência da associação incluíram isolamento do vírus com posterior visualização de sua morfologia por microscopia eletrônica, detecção do genoma viral e sorologia positiva em amostras dos pacientes. , Nos dois trabalhos foram analisados também grupos-controle. Ao discutir a relação de causalidade entre o vírus HNF e a síndrome grave com febre e trombocitopenia, os dois grupos se referiram aos postulados de Koch e concluíram que, apesar de não os terem preenchido, são fortes as evidências da associação. , O fato de investigadores independentes terem confirmado os resultados , , corrobora a potencial associação, como sugerem os critérios de Lipkin.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A metagenômica viral tem mostrado grande impacto na descoberta de novos vírus, pelas suas características de possibilitar a detecção de todos os genomas virais presentes em uma amostra, e por independer de antissoros, de conhecimento prévio do genoma viral (diferentemente de outras técnicas de biologia molecular como PCR, microarray e hibridização in situ) e de isolamento em cultura de células. , ,

A relação de causalidade entre um vírus e uma doença no homem e outros animais, no entanto, continua dependendo de um conjunto de investigações clínicas, epidemiológicas e laboratoriais, do uso de critérios estritos para associá-los, como os postulados de Koch e os que dele advieram, e do bom senso dos pesquisadores ao analisar esses dados. , , , , ,