MHC structure and function – antigen presentation. Part 1.

The setting for the occurrence of an immune response is that of the need to cope with a vast array of different antigens from both pathogenic and non-pathogenic sources. When the first barriers against infection and innate defense fail, adaptive immune response enters the stage for recognition of the antigens by means of extremely variable molecules, namely immunoglobulins and T-cell receptors. The latter recognize the antigen exposed on cell surfaces, in the form of peptides presented by the HLA molecule. The first part of this review details the central role played by these molecules, establishing the close connection existing between their structure and their antigen presenting function.

HLA MOLECULES: A DIRECT CONNECTION BETWEEN STRUCTURE AND ANTIGEN PRESENTING FUNCTION

In the mammalian genome and, more specifically, in the human genome the most variable region known forms the Major Histocompatibility Complex (MHC) that carries a great number of different loci coding for functional genes. Some of these genes also exhibit many variants (alleles), characterizing an extremely polymorphic region.( ) These genes belong to the human leukocyte antigen (HLA) system and code for the major molecules in charge of antigen presentation on the cell surface. The HLA system was described by J. Dausset, in 1958, in a work which earned him the Nobel Prize, in 1980.( ) Up to April 2014, a total of 11,225 sequenced alleles were known throughout the world, all found in the 30 HLA genes located in the MHC genomic region (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html). Of note, though the genes are called HLA, many authors use MHC to designate the molecules resulting from the expression of these genes, and both names will be used throughout this text.

In humans, the MHC region is approximately 4,000-kb-long, located on the short arm of chromosome 6 (6p 21.3). These genes, whether or not expressed, are arranged in three genomic regions or classes. The more distal region corresponds to MHC class I, which carries the genes that code for the classic (1a) class I HLA- A, -B, and -C heavy chains. An extraordinary degree of polymorphism characterizes these genes (2,735 alleles at HLA-A, 3,455 alleles at HLA-B and 2,259 alleles at HLA-C loci), and the vast majority of these alleles are functional. There are also so-called non-classic HLA loci coding for the expressed, though less variable, genes HLA- E, -F, -G, HFE, and the MHC class I Chain-related MICA and MICB. With the notable exception of the MIC genes, all class I HLA (HLAI) molecules form heterodimers with the invariant β2-microglobulin chain, coded by a gene on chromosome 15. All nucleated cells express class I molecules on their cell surface.

On the other hand, class II MHC genes, coding for both chains that will form the functional heterodimer, HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DM, and HLA-DO (2,649 known alleles) are located in the more centromeric portion of the MHC region. Initially denominated Ir (from immune response), from early on these genes were recognized for their control of the immune response.( ) They exhibit restricted expression, being predominantly expressed on antigen-presenting cells (APC), such as macrophages, dendritic cells, Langerhans and Kupffer cells, as well as B lymphocytes. Some cells exhibit class II HLA (HLAII) under certain anomalous conditions. This is the case for thyrocytes( ) and intestinal epithelial cells( ) where the expression is induced during inflammatory processes.

A third genomic region, located between the two, carries numerous genes unrelated to MHC, some of which have important immunological functions. Well-known examples are CBF, C2, and C4A complement genes, a group of tumor necrosis factor (TNF), and heat shock protein 70 (HSP70) chaperoning genes.( , ) The list of the many additional genes includes peptide transporter proteins TAP1 and TAP2, and PSMB8 and PSMB9 genes that code for components of the β-immunoproteasome, to which we will return later in this text.( ) The genomic organization of the MHC region is an essential feature to understand how the expression and forming of the HLA molecules are regulated and coupled to their antigen presenting function.

Both class I and class II genes present different regulatory sequences located in their upstream (5’) portion that guarantee constitutive transcription and cytokine-induced regulation of expression, but some are also shared by HLA genes of the same class, and therefore, allow parallel transcription. HLA genes are also regulated by class-specific trans-activators, respectively CITA( ) and CIITA,( ) and the ubiquitous nuclear factor kappa B (NF-Kb) is a HLAI regulator shared with many other genes. These and other factors carry out the fine-tuning of HLA molecule production and function in each tissue or cell type.

HLAI and HLAII proteins exhibit strong structural similarity. Just like the class I heterodimer formed by an α heavy chain and β2-microglobulin, class II molecules are also heterodimers formed by α and β chains, coded by A and B genes, respectively. In the class II MHC region, we find only HLA-DRA1, but depending on the haplotype (set of genes found on the same chromosome stretch) one or more expressed HLA-DRB genes may be seen. Therefore, some haplotypes carry one sole HLA-DRB1 functional allele whereas others carry additional expressed alleles at the HLA-DRB3, 4, or 5 loci. All these DRB genes exhibit a high degree of polymorphism. For example, 1,091 different DR beta chains are known. On the other hand, HLA-DQA1 and HLA-DQB1, HLA-DPA1, and HLA-DPB1 loci, all polymorphic, form HLA-DQ and HLA-DP heterodimers, both in cis and in trans, with similar but not identical structure and function to HLA-DR. Non-classic class II genes form the invariant molecules HLA-DO and HLA-DM, which carry out highly specialized functions in peptide presentation.

Each of us carries a pair of chromosomes 6 hence will express on the surface of a single antigen-presenting cell 1 or 2 HLA-A, 1 or 2 HLA-B, 1 or 2 HLA-C, several HLA 1b, in addition to 1 to 4 HLA-DR, 1 to 4 HLA-DQ, 1 to 4 HLA-DP molecules, comprising hundreds of thousands different units.( , ) As each of us carries a unique set of HLA genes, the array of possible combinations expressed by each individual in a given population is enormous. This HLA diversity allied to the multiplicity of alleles leads to the extraordinary potential of antigen presentation not only in one individual, but in a group of individuals, a concept extended to a whole population.

In contrast with this variability, the basic design of an HLAI or HLAII molecule is quite similar, forming a goblet anchored to the cell membrane by way of one or two chains, as short chain β2-microglobulin confers stability without attaching to the membrane. The external part of the goblet, comprising domains alpha 1 and 2 in the class I molecules and domains alpha 1 and beta 1 in the class II molecules, exhibits a groove, made up of a floor composed of 8 anti-parallel β sheet strands and an α-helical border.( , ) The HLA grooves have pockets where the antigen-derived peptides (usually 9 amino acids long) are lodged for presentation to the T-cell receptor (TCR).( ) The HLAI groove formed only by the α chain is closed, but the HLAII groove formed by the juxtaposition of α and β chains is open, which permits the lodging of peptides longer than the groove itself. The original papers referred to above also carry detailed computerized views of these complex molecules.

The uniqueness of this molecular design is highlighted when the thousands of sequences from the known alleles are compared. The variability of the proteins, reflected in the corresponding DNA sequence, is predominantly clustered in certain portions of the genes. These hypervariable regions, as occurs with immunoglobulin receptors and TCR, are found mainly on the external part of the molecule, inside and in the borders of the groove, that is, precisely at the site where the peptides are lodged, in contrast to the rest of the molecule, the alpha 3 domain in the class I molecules and alpha 2 and beta 2 domains in the class II molecules, where the sequence is highly conserved. The amino acids that form the floor and sides of the groove create a motif or pattern, specific for each allelic variant, which defines what kind of peptide will fit into the groove and bind to that HLA molecule.( ) Of note, the peptides need only bind to some of the available residues within the groove leaving the rest of the amino acids in the sequence free. In spite of constraints imposed by the unique motif, this limited anchoring allows an impressive variety of peptides to be presented by each HLA groove.( )

The single most important reason ensuring the success of peptide presentation by HLA molecules becomes clear when we consider the molecules in charge of recognizing the peptide-HLA complex: the TCR.

TCRs are produced by gene rearrangements carried out by a unique enzymatic complex called rag (recombination-activating gene) where gene segments are joined to form a novel gene coding for alpha, beta, gamma, or delta TCRs whilst eliminating the intervening DNA sequences. For example, to form the beta chain of a TCR, 52 V (variable) segments, 2 D (diverse) segments, and 13 J (joining) segments are reshuffled to form a single functional VDJ segment, which will be processed together with a C (constant) segment to form the final beta chain. This TCR DNA rearrangement is quite random and thus, each T-lymphocyte will express a unique TCR. Researchers calculate that 1016 αβ and 1018 γδ TCRs can be generated, each with a highly variable portion specifically placed in the part of the molecule contacting the HLA-peptide complex. This ensures a vast array of molecular variants capable of recognizing any presented antigen. In the second part of this review we will show how these antigens are prepared for presentation to the T-lymphocyte in order to guarantee a recognition that will lead to activation and clonal expansion of the T-cells in charge of the adaptive immune response. Finally, the unique design and variability of HLA class I molecules serves also to regulate natural killer (NK) cells by way of a specific group of receptors, the killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs).( ) Though peptides have been shown to interfere in the recognition by KIRs,( ) antigen presentation is not involved in the basic functions of these ligand-receptor pairs and is beyond the scope of this article. For more information we refer excellent reviews.( , , )

MOLÉCULAS HLA: UMA CONEXÃO DIRETA ENTRE ESTRUTURA E FUNÇÃO DE APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENO

No genoma de mamíferos e, mais especificamente, no genoma humano, a região mais variável conhecida forma o complexo principal de histocompatibilidade (MHC - Major Histocompatibility Complex), que carrega um grande número de diferentes loci, que codificam genes funcionais. Alguns desses genes também exibem muitas variantes (alelos), caracterizando uma região extremamente polimórfica.( ) Esses genes pertencem ao sistema de antígenos leucocitários humanos (HLA, human leukocyte antigen) e codificam as principais moléculas encarregadas da apresentação do antígeno na superfície celular. O sistema HLA foi descrito por J. Dausset, em 1958, em um trabalho que lhe rendeu o Prêmio Nobel, em 1980.( ) Até abril de 2014, um total de 11.225 alelos sequenciados já era conhecido em todo o mundo, todos encontrados nos 30 genes HLA localizados na região genômica do MHC (http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html). É importante notar que, embora esses genes sejam conhecidos como HLA, muitos autores usam MHC para designar as moléculas resultantes da expressão desses genes, e ambos os nomes são usados no decorrer deste texto.

Em humanos, a região do MHC, com aproximadamente 4.000kb de comprimento, localiza-se no braço curto do cromossomo 6 (6p 21.3). Esses genes, expressos ou não, estão dispostos em três regiões ou classes genômicas. A região mais distante corresponde ao MHC de classe I, que contém os genes que codificam as cadeias pesadas clássicas (1a) HLA- A, -B, e -C. Um grau extraordinário de polimorfismo caracteriza esses genes (2.735 alelos nos lócus em HLA-A, 3.455 alelos em HLA-B e 2.259 alelos em HLA-C) e a maioria desses alelos é funcional. Também existem os chamados loci não clássicos de HLA de classe I, que codificam os genes HLA- E, -F, -G, HFE, e MICA e MICB (relacionado a MHC de classe I A e B), que são expressos, mas são menos variáveis. Com a notável exceção dos genes MIC, todas moléculas HLA de classe I (HLAI) formam heterodímeros com a cadeia invariante β2-microglobulina, codificada por um gene no cromossomo 15. Todas as células nucleadas expressam moléculas de classe I em sua superfície celular.

Por outro lado, os genes MHC de classe II que codificam as duas cadeias que formam os heterodímeros funcionais HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP, HLA-DM e HLA-DO (2.649 alelos conhecidos) se localizam na porção mais centromérica da região do MHC. Inicialmente chamada de Ir (do inglês, immune response), desde cedo esses genes têm sido reconhecidos por seu controle da resposta imunológica.( ) Eles exibem expressão restrita, sendo predominantemente expressos em células apresentadoras de antígenos (APC, do inglês antigen-presenting cells), como macrófagos, células dendríticas, células de Langerhans e de Kupffer, assim como linfócitos B. Algumas células exibem HLA classe II (HLAII) sob certas condições anômalas. Este é o caso de tireócitos( ) e de células epiteliais intestinais,( ) onde a expressão é induzida durante processos inflamatórios locais.

Uma terceira região genômica, localizada entre os dois, carrega numerosos genes não relacionados ao MHC, alguns dos quais têm importantes funções imunológicas. Exemplos bem conhecidos são os genes CBF, C2 e C4A do complemento, o grupo de genes de fatores de necrose tumoral (TNF), e genes que codificam chaperonas, as proteínas de choque térmico 70 (HSP70).( , ) A lista dos muitos genes adicionais inclui as proteínas transportadoras de peptídeos TAP1 e TAP2, e PSMB8 e PSMB9, genes que codificam componentes do β-imunoproteassomo, ao qual retornaremos mais adiante neste texto.( ) A organização genômica da região MHC é um aspecto essencial para a compreensão de como a expressão e a formação das moléculas de HLA são reguladas e acopladas à sua função de apresentação de antígeno.

Tanto genes de classe I como os de classe II apresentam diferentes sequências regulatórias localizadas em sua porção à montante (upstream) (5’), que garantem a transcrição constitutiva e a regulação de expressão induzida por citocinas, mas algumas também são compartilhadas por genes HLA da mesma classe e, portanto, permitem a transcrição em paralelo. Os genes HLA são também regulados por transativadores específicos de classe (class-specific trans-activators), respectivamente CITA( ) e CIITA,( ) e o fator nuclear kappa B (NF-Kb) ubíquo é um regulador de HLAI compartilhado com muitos outros genes. Estes e outros fatores são responsáveis pelo ajuste fino da produção e função das moléculas HLA em cada tecido ou tipo celular.

As proteínas HLAI e HLAII exibem forte similaridade estrutural. Assim, como o heterodímero de classe I é formado por uma cadeia α pesada e a β2-microglobulina, as moléculas de classe II são também heterodímeros formados por cadeias α e β, codificadas pelos genes A e B, respectivamente. Na região MHC de classe II, encontramos apenas HLA-DRA1, mas, dependendo do haplótipo (conjunto de genes encontrados no mesmo trecho de cromossomos), um ou mais genes HLA-DRB expressos poderão ser encontrados. Assim, alguns haplótipos carregam um único alelo funcional HLA-DRB1, enquanto outros carregam alelos adicionais expressos nos loci HLA-DRB3, 4 ou 5. Todos esses genes DRB exibem um alto grau de polimorfismo. Por exemplo, 1.091 diferentes cadeias DR beta são conhecidas. Por outro lado, os loci HLA-DQA1 e HLA-DQB1, HLA-DPA1 e HLA-DPB1, todos polimórficos, formam heterodímeros HLA-DQ e HLA-DP, tanto em cis como em trans, com estrutura e função similar, mas não idêntica a de HLA-DR. Genes não clássicos de classe II formam as moléculas invariantes HLA-DO e HLA-DM, que desempenham funções altamente especializadas na apresentação de peptídeos.

Cada um de nós carrega um par de cromossomos 6 e, portanto, expressará na superfície de uma única célula apresentadora de antígeno 1 ou 2 HLA-A, 1 ou 2 HLA-B, 1 ou 2 HLA-C, vários HLA 1b, além de 1 a 4 moléculas HLA-DR, 1 a 4 HLA-DQ, 1 a 4 HLA-DP, perfazendo centenas de milhares de diferentes unidades na superfície de cada célula.( , ) À medida que cada um de nós carrega um conjunto singular de genes HLA, a diversidade das combinações possíveis presentes em cada indivíduo em uma dada população é imensa. Essa diversidade de HLA, aliada à multiplicidade de alelos, leva ao extraordinário potencial de apresentação de antígeno não apenas em um indivíduo, mas em um grupo de indivíduos − um conceito que pode ser estendido para uma população inteira.

Em contraste com essa variabilidade, o desenho básico de uma molécula HLAI ou HLAII é muito similar, formando uma taça ancorada à membrana celular, por meio de uma ou duas cadeias, sendo que a cadeia curta β2-microglobulina confere estabilidade sem se fixar na membrana. A parte externa da taça, que inclui os domínios alfa 1 e alfa 2, nas moléculas de classe I, e domínios alfa 1 e beta 1, nas moléculas da classe II, exibe uma fenda, constituída de um piso composto de 8 fitas antiparalelas, tipo folheto β e uma borda em α-hélice.( , ) As fendas HLA têm bolsões em que os peptídeos derivados dos antígenos (geralmente com comprimento de 9 aminoácidos) estão alojados para apresentação ao receptor de célula-T (TCR, T-cell receptor).( ) A fenda HLAI formada apenas pela cadeia α é fechada, mas a fenda HLAII formada pela justaposição de cadeias α e β é aberta, o que permite o alojamento de peptídeos mais longos que a própria fenda. Os trabalhos originais mencionados acima também contêm visualizações detalhadas computadorizadas dessas moléculas complexas.

A singularidade desse desenho molecular é ainda mais evidente quando as milhares de sequências dos alelos conhecidos são comparadas. A variabilidade das proteínas, refletidas na sequência correspondente de DNA, é predominantemente agrupada em certas porções dos genes. Essas regiões hipervariáveis, como ocorre com receptores de imunoglobulina e TCR, são encontradas principalmente na parte externa da molécula, dentro e nas bordas da fenda, isto é, bem no local onde os peptídeos estão alojados, em contraste com o resto da molécula, ou seja, o domínio alfa 3 nas moléculas classe I, e domínios alfa 2 e beta 3 nas moléculas de classe II, onde a sequência é muito preservada. Os aminoácidos que formam o piso e os lados da fenda criam um motivo ou padrão, específico para cada alelo, que define o tipo de peptídeo que se encaixará na fenda, ligando-se àquela molécula HLA.( ) É importante salientar que os peptídeos necessitam apenas se fixar a alguns dos resíduos disponíveis dentro da fenda, deixando o restante dos aminoácidos na sequência livre. A despeito das limitações impostas por um padrão único, esse ancoramento limitado permite que uma variedade impressionante de peptídeos seja apresentada por cada fenda HLA.( )

A principal razão de garantia do sucesso de apresentação de peptídeos por moléculas HLA se torna clara quando consideramos as moléculas responsáveis por reconhecer o complexo peptídeo-HLA: o TCR.

Os TCRs são produzidos por rearranjos de genes desenvolvidos por um complexo enzimático singular, chamado rag (recombination-activating gene), em que segmentos de genes são ajuntados para formar um novo gene que codifica TCRs alfa e beta, ou gama e delta, enquanto elimina as sequências de DNA intervenientes. Por exemplo, para formar a cadeia beta de um TCR, 52 segmentos V (variáveis), 2 segmentos D (diversos) e 13 segmentos J (juncionais) são redistribuídos de maneira a formar um único segmento funcional VDJ, que será processado juntamente de um segmento C (constante), para formar a cadeia beta final. Esse rearranjo do DNA dos genes de TCR é bem aleatório e, assim, cada linfócito-T expressará um TCR singular. Pesquisadores calculam que 1016 αβ e 1018 γδ TCRs podem ser gerados, cada qual com uma porção altamente variável especificamente posicionada na parte da molécula de contato com o complexo HLA-peptídeo. Isso garante uma ampla variedade de variantes moleculares capazes de reconhecer qualquer antígeno presente no sistema. Na segunda parte desta revisão, mostraremos como esses antígenos são preparados para apresentação ao linfócito T a fim de garantir um reconhecimento, que levará à ativação e à expansão clonal das células-T encarregadas da resposta imune de adaptação. Finalmente, o desenho único e a variabilidade das moléculas HLA classe I servem também para regular as células natural killer (NK) por meio de um grupo específico de receptores similares a imunoglobulinas, chamados killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIRs).( ) Embora tenha sido demonstrado que peptídeos interferem no reconhecimento por KIRs,( ) a apresentação de antígenos não está envolvida nas funções básicas desses pares de ligante-receptor e está além do escopo deste artigo. Para mais informações, indicamos excelentes revisões.( , , )