Effects of acute and chronic administration of methylprednisolone on oxidative stress in rat lungs.

OBJECTIVE: To determine the effects of acute and chronic administration of methylprednisolone on oxidative stress, as quantified by measuring lipid peroxidation (LPO) and total reactive antioxidant potential (TRAP), in rat lungs.
METHODS: Forty Wistar rats were divided into four groups: acute treatment, comprising rats receiving a single injection of methylprednisolone (50 mg/kg i.p.); acute control, comprising rats i.p. injected with saline; chronic treatment, comprising rats receiving methylprednisolone in drinking water (6 mg/kg per day for 30 days); and chronic control, comprising rats receiving normal drinking water.
RESULTS: The levels of TRAP were significantly higher in the acute treatment group rats than in the acute control rats, suggesting an improvement in the pulmonary defenses of the former. The levels of lung LPO were significantly higher in the chronic treatment group rats than in the chronic control rats, indicating oxidative damage in the lung tissue of the former.
CONCLUSIONS: Our results suggest that the acute use of corticosteroids is beneficial to lung tissue, whereas their chronic use is not. The chronic use of methylprednisolone appears to increase lung LPO levels.

Introduction

Corticosteroids are extensively used in a wide range of respiratory tract disorders, such as asthma, allergic rhinitis, and COPD.( ) It has been observed that acute treatment with corticosteroids can suppress inflammatory processes and reactive oxygen species (ROS) production. ( ) In a recent study,( ) it was shown that the administration of dexamethasone decreases lung tissue malondialdehyde production after ischemia/reperfusion injury and protects cellular levels of antioxidant enzymes. In addition, short-term administration of prednisolone or dexamethasone has been shown to inhibit ROS generation in platelets, and there is evidence that steroids inhibit oxidative phosphorylation.( ) It has been suggested that the long-term use of corticosteroids at low doses (1-2 mg/kg per day) can benefit the lungs and reduce the risk of systemic side effects in patients with acute respiratory distress syndrome,( ) whereas acute administration of high doses of corticosteroids has been found to produce no benefits in such patients.( )

Chronic treatment with corticosteroids can induce a variety of symptoms and signs (side effects), including truncal obesity, facial swelling ("moon face"), cutaneous striae, hirsutism, cataract, osteoporosis, myopathy, diabetes mellitus, immunosuppression, and cardiovascular disorders.( ) Excess corticosteroid use can also induce overproduction of ROS by endothelial cells.( )

It is well known that corticosteroids have anti-inflammatory effects, some of which can be mediated by ROS, which are products of normal metabolic processes in cells. The major sources of ROS are leakages from the electron transport chain in mitochondria and endoplasmic reticulum. Another important source of ROS is a membrane-associated NADH/NADPH oxidase. At low concentrations, ROS act as physiological mediators of cellular responses and regulators of gene expression.( ) The imbalance between the production of ROS and antioxidant defenses leads to oxidative stress.( ) Oxidative stress has been implicated as an important pathologic factor in pulmonary, neurodegenerative, and autoimmune diseases, as well as in metabolic disorders, cancer, and aging.( - ) It is well known that ROS generate a biochemical cascade, producing lipid peroxidation (LPO), protein oxidation, DNA damage, and cell death, all of which can contribute to the occurrence of pathological conditions associated with a marked increase in ROS and other free radicals,( ) such as ischemia/reperfusion-induced lung injury.( ) Therefore, ROS play a crucial role in the cascade of events that lead to lung failure.

Taking all of the above into account, we conducted the present study with the objective of determining the effect of acute and chronic administration of methylprednisolone on oxidative stress. To that end, we quantified LPO and total reactive antioxidant potential (TRAP) in rat lungs.

Methods

Forty experimentally naive adult (60-day-old) male Wistar rats (200-250 g) were randomized by weight and housed in groups of five in polypropylene home cages (49 × 34 ×16 cm). All animals were maintained on a standard 12/12-h light/dark cycle (lights on at 7:00 a.m. and off at 7:00 p.m.) in a temperature-controlled environment (22 ± 2°C) and were given ad libitum access to water and chow. All experiments and procedures were approved by the institutional animal care and use committee and were in compliance with the Brazilian guidelines involving the use of animals in research (Law no. 11,794) and with international guidelines. Vigorous attempts were made to minimize animal suffering and to decrease external sources of pain and discomfort, as well as to use only the number of animals required in order to produce reliable scientific data.

We used methylprednisolone sodium succinate (Solu-Medrol(r), Pharmacia, New York, NY, USA). The lyophilized powder (500 mg) was dissolved in 8 mL of 0.9% saline solution. The drug solution was prepared immediately prior to its administration.

In the acute treatment experiment, the animals were divided into two groups (n = 10 each). The rats in one group (the acute treatment group) received a single injection of methylprednisolone (50 mg/kg, i.p.) in a volume of 1 mL/kg of the solution, whereas those in the other group (the acute control group) were injected with an equal volume of saline (i.p.).

In the chronic treatment experiment, the animals were divided into two groups (n = 10 each). The rats in one group (the chronic treatment group) received methylprednisolone (6 mg/kg per day, p.o.) in drinking water for 30 days, whereas those in the other group (the chronic control group) received drinking water only. Each 500 mL of the drinking water contained 31 mg of methylprednisolone sodium succinate (0.0625 mg/mL). Considering a mean consumption of 25 mL/day per rat, each chronic treatment group rat consumed 1.56 mg of methylprednisolone per day.

At 24 h after acute administration or at the end of the chronic treatment period, the animals were killed by decapitation. The lungs were extracted and frozen by immersion in liquid nitrogen. Samples were stored at −80°C until analysis. The lungs were weighed and homogenized at 1:5 w/v in ice-cold (1.15% KCl and 20 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride) fluid using an Ultra-Turrax homogenizer (IKA, Toronto, Ontario, Canada). To remove the particulate fraction, the homogenates were centrifuged at 1,000 g for 20 min at 0-4°C, and the supernatant was used for LPO, TRAP, and protein content assays.( )

The level of TRAP was determined by measuring luminol chemiluminescence intensity induced by the thermolysis of 2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride.( ) The results are expressed as µM of 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid per mg of protein. We quantified LPO using chemiluminescence. The method is highly sensitive and capable of detecting small amounts of peroxidation products. Chemiluminescence was measured in a liquid scintillation counter using the out-of-coincidence mode (LKB Rack Beta Liquid Scintillation Spectrometer 1215; LKB Produkter AB, Bromma, Sweden). The reactions were started by the addition of 3 mmol/L tert-butyl hydroperoxide, and the data are expressed as counts per second (cps) per mg of protein in the homogenate.( ) Protein levels were measured with the method devised by Lowry et al.,( ) and bovine serum albumin was used as the standard.

The data are expressed as mean ± SE and statistically evaluated using the Student's t-test. Values of p < 0.05 were considered significant.

Results

We first evaluated the effect of acute treatment with methylprednisolone on the levels of TRAP and LPO in rat lungs. A significant (20%) increase was observed in total TRAP levels in the treated group (p < 0.05; Figure 1). No significant difference was found between the groups regarding LPO levels (p > 0.05; Figure 2).

Figure 1

Mean levels of total reactive antioxidant potential (TRAP) in the lungs of rats subjected to acute administration of methylprednisolone (acute treatment group) or injected with an equal volume of saline (acute control group). Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid. *p < 0.05, Student's t-test.

Figure 2

Mean levels of lipid peroxidation in the lungs of rats subjected to acute administration of methylprednisolone (acute treatment group) or injected with an equal volume of saline (acute control group). CL: chemiluminescence; and cps: counts per second.

We found no difference between the chronic treatment group and the chronic control group in terms of the total TRAP levels (p > 0.05; Figure 3). The degree of pulmonary oxidative damage, as assessed by chemiluminescence, was significantly (38%) greater in the chronic treatment group than in the chronic control group (p < 0.05; Figure 4).

Figure 3

Mean levels of total reactive antioxidant potential (TRAP) in the lungs of rats subjected to chronic administration of oral methylprednisolone (chronic treatment group) or not (chronic control group). Trolox: 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid.

Figure 4

Mean levels of lipid peroxidation in the lungs of rats subjected to chronic administration of oral methylprednisolone (chronic treatment group) or not (chronic control group). CL: chemiluminescence; and cps: counts per second. *p < 0.05, Student's t-test.

Discussion

Antioxidant concentrations in the lungs can be quantified by determining the level of TRAP. ( , ) The relative concentration of antioxidants determines the total tissue antioxidant capacity. The TRAP level primarily represents non-enzymatic water-soluble antioxidants in the tissue. In addition, the level of LPO, which plays an important role in the induction of free radical formation and apoptosis,( ) is widely used as a marker of oxidative stress.

The results of the present study show that the duration of corticosteroid treatment alters the oxidative system responses in the lungs of rats. Acute treatment with methylprednisolone induced a significant increase in TRAP levels in rat lungs without any changes in LPO levels. However, when the treatment was maintained for 30 days, we observed an increase in LPO levels without any changes in TRAP levels, which increases the risk of oxidative lung injury. Nevertheless, when animals were submitted to methylprednisolone treatment for 15 days at a lower dose, none of those effects were observed (data not shown).

The increased antioxidant potential induced by short-term administration of methylprednisolone might represent a mechanism of protection against ROS generation after exposure to corticosteroids. ROS can be generated as a consequence of the intracellular metabolism of foreign compounds, toxins, or drugs by the cytochrome P450 monooxygenase system, as well as because of exposure to environmental factors, such as excessive iron salts or UV irradiation.( ) Intracellular antioxidants, cell membranes, and extracellular fluids can be upregulated and mobilized in order to neutralize excessive and inappropriate ROS formation. To provide extracellular antioxidant defense mechanisms, respiratory tract epithelial cells synthesize and secrete various antioxidant enzymes, such as extracellular forms of superoxide dismutase( ) and glutathione peroxidase,( ) as well as several metal-binding proteins (e.g., transferrin and ceruloplasmin) that minimize the involvement of transition metal ions (e.g., iron and copper) in oxidative reactions.( ) In addition, the extracellular epithelial lining fluid also contains various non-enzymatic antioxidant systems, including vitamin C (ascorbate) and vitamin E (alpha-tocopherol).( ) The TRAP assay employed in the current study is widely used,( , , ) and it mostly measures non-enzymatic water-soluble antioxidants, such as glutathione, ascorbic acid, and uric acid. The measurement of all of these antioxidants is essential for assessing antioxidant status. However, the number of different antioxidants in biological samples makes it difficult to measure each separately. In addition, the possible interaction among different antioxidants can make measurements of individual antioxidants less representative than is the overall antioxidant status.( )

Our results corroborate those of previous studies, suggesting that short-term administration of corticosteroids is protective against oxidative injury in different tissues in experimental models.( ) The short-term administration of prednisolone and dexamethasone has been shown to inhibit ROS generation in platelets, and there is evidence that corticosteroids also inhibit oxidative phosphorylation.( ) In contrast, we found that 30 days of methylprednisolone treatment increased LPO levels. The chemiluminescence assay is the easiest method and can be applied to crude biological extracts. Although its specificity has been questioned,( ) this particular assay is widely used for ex vivo and in vitro measurements,( ) and it is accepted as an empirical window for the examination of the complex process of LPO.( ) However, the imbalance between production of ROS and antioxidant defenses in the body is called oxidative stress, which has major health implications.( ) If there are too many ROS or too few antioxidants for protection, oxidative stress develops, which can cause permanent damage.( ) Although the differences were less than significant, we found that long-term administration of a corticosteroid induced a decrease in TRAP levels and an increase in LPO levels, suggesting that oxidative stress occurred.

One of the earliest and most important components of tissue injury after reperfusion of ischemic organs is ROS production. The major ROS include the superoxide radical, the hydroxyl radical, and hydrogen peroxide. ROS-induced injury targets proteins, enzymes, nucleic acids, cytoskeleton, cell membranes, and lipid peroxides, resulting in decreased mitochondrial function and LPO.( ) The damage caused by ROS leads to the loss of microvascular integrity and decreased blood flow. The pathogenesis of the various forms of lung injury has been shown to involve peroxidative breakdown of polyunsaturated fatty acids (due to the effects on membrane function); inactivation of membrane-bound receptors and enzymes; and increased tissue permeability.( ) There is increasing evidence that aldehydes, which are generated endogenously during the LPO process, are involved in many of the pathophysiological events associated with oxidative stress in cells and tissues.( ) In addition to their cytotoxic properties, lipid peroxides have been increasingly recognized as being important in signal transduction for a number of important events in the lung inflammatory response.( ) The oxidative pathway was reported to play a significant role in the etiology of remote lung injury in a rabbit model of hepatoenteric ischemia-reperfusion, as well as in other animal models.( )

It is important to emphasize that, by choosing two different administration regimens of methylprednisolone (acute and chronic), we sought to simulate the parenteral administration of high doses, which might be warranted in emergencies, such as in severe acute asthma, and a moderate oral dose, which is used under less urgent circumstances in humans. It should be borne in mind that drug metabolism is more rapid in small animals than in humans, and larger doses are therefore necessary.( ) Nevertheless, the fact that we used different drug dose regimens in the two treatments represents a limitation of the present study, because it constitutes a confounding variable.

In conclusion, our results suggest that the acute use of corticosteroids is beneficial to lung tissue, whereas their chronic use is not. In addition, we found that acute administration of methylprednisolone increased antioxidant levels in the lung tissue in rats, which is an important finding, considering the use of this medication in acute events and in lung transplantation. Conversely, the negative effect that chronic treatment with methylprednisolone has on LPO might play a role in the mechanisms of the adverse effects involved in pathological conditions associated with the chronic use of glucocorticoids. Future studies using rat models of ischemia/reperfusion injury in lungs might elucidate the differences between acute and chronic use of corticosteroids, in terms of the mechanisms by which they act on a pathological condition.

Introdução

Os corticosteroides são amplamente usados em uma vasta gama de doenças respiratórias, como a asma, a rinite alérgica e a DPOC.( ) Observou-se que o tratamento agudo com corticosteroides pode suprimir processos inflamatórios e a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO).( ) Em um estudo recente,( ) demonstrou-se que a administração de dexametasona reduz a produção de malondialdeído no tecido pulmonar após a lesão de isquemia/reperfusão e protege os níveis celulares de enzimas antioxidantes. Além disso, demonstrou-se que a administração de prednisolona ou dexametasona em curto prazo inibe a geração de ERO em plaquetas, e há evidências de que os esteroides inibem a fosforilação oxidativa.( ) Sugeriu-se que o uso de baixas doses de corticosteroides (1-2 mg/kg por dia) em longo prazo pode beneficiar os pulmões e reduzir o risco de efeitos colaterais sistêmicos em pacientes com síndrome da angústia respiratória aguda,( ) ao passo que a administração aguda de altas doses de corticosteroides não traz nenhum benefício a esses pacientes.( )

O tratamento crônico com corticosteroides pode induzir vários sintomas e sinais (efeitos colaterais), tais como obesidade de tronco, edema facial ("fácies de lua cheia"), estrias cutâneas, hirsutismo, catarata, osteoporose, miopatia, diabetes mellitus, imunossupressão e doenças cardiovasculares.( ) O uso excessivo de corticosteroides pode também induzir a superprodução de ERO pelas células endoteliais.( )

Sabe-se bem que os corticosteroides têm efeitos anti-inflamatórios, alguns dos quais podem ser mediados por ERO, que são produtos de processos metabólicos normais nas células. As principais fontes de ERO são vazamentos na cadeia de transporte de elétrons nas mitocôndrias e no retículo endoplasmático. Outra importante fonte de ERO é uma NADH/NADPH oxidase presente na membrana celular. Em baixas concentrações, as ERO atuam como mediadores fisiológicos de respostas celulares e reguladores de expressão gênica.( ) O desequilíbrio entre a produção de ERO e as defesas antioxidantes leva ao estresse oxidativo.( ) O estresse oxidativo foi considerado um importante fator patológico em doenças pulmonares, neurodegenerativas e autoimunes, bem como em doenças metabólicas, câncer e envelhecimento.( - ) Sabe-se bem que as ERO geram uma cascata bioquímica, produzindo peroxidação lipídica (POL), oxidação de proteínas, danos ao DNA e morte celular, que podem contribuir para a ocorrência de patologias relacionadas com um aumento acentuado de ERO e outros radicais livres,( ) como por exemplo a lesão pulmonar induzida por isquemia/reperfusão.( ) Portanto, as ERO desempenham um papel crucial na cascata de eventos que levam à insuficiência pulmonar.

Levando em conta o exposto acima, realizamos o presente estudo com o objetivo de determinar o efeito da administração aguda e crônica de metilprednisolona sobre o estresse oxidativo. Para isso, quantificamos a POL e o potencial antioxidante reativo total (PART) em pulmões de ratos.

Métodos

Quarenta ratos Wistar machos adultos (idade: 60 dias; peso: 200-250 g) que nunca haviam sido submetidos a nenhum tipo de experimento foram aleatoriamente divididos por peso e alojados em grupos de cinco em gaiolas caseiras de polipropileno (49 × 34 × 16 cm). Todos os animais foram mantidos em ciclo claro-escuro de 12 h (luzes acesas das 7h00 às 19h00) em um ambiente com temperatura controlada (22 ± 2°C) e água e ração à vontade. Todos os experimentos e procedimentos foram aprovados pelo comitê institucional de tratamento e uso de animais e foram realizados em conformidade com as diretrizes brasileiras para o uso de animais em pesquisa (Lei nº 11.794) e com diretrizes internacionais. Fizemos grande esforço para minimizar o sofrimento dos animais e diminuir fontes externas de dor e desconforto, bem como para usar apenas o número de animais necessário para produzir dados científicos confiáveis.

Usamos succinato sódico de metilprednisolona (Solu-Medrol(r); Pharmacia, Nova Iorque, NY, EUA). O pó liofilizado (500 mg) foi dissolvido em 8 mL de solução salina a 0,9%. A solução da droga foi preparada imediatamente antes de sua administração.

No experimento com tratamento agudo, os animais foram divididos em dois grupos de 10 animais cada. Os ratos em um dos grupos (o grupo de tratamento agudo) receberam uma única injeção (i.p.) de metilprednisolona (50 mg/kg) em um volume de 1 mL/kg da solução, ao passo que os do outro grupo (o grupo de controle agudo) receberam injeção i.p. do mesmo volume de solução salina.

No experimento com tratamento crônico, os animais foram divididos em dois grupos de 10 animais cada. Os ratos em um dos grupos (o grupo de tratamento crônico) receberam metilprednisolona (6 mg/kg por dia v.o.) na água do bebedouro durante 30 dias, ao passo que os do outro grupo (o grupo de controle crônico) receberam apenas água do bebedouro. Cada 500 mL da água do bebedouro continha 31 mg de succinato sódico de metilprednisolona (0,0625 mg/mL). Considerando-se um consumo médio de 25 mL/dia por rato, cada rato do grupo de tratamento crônico consumiu 1,56 mg de metilprednisolona por dia.

Vinte e quatro horas após a administração aguda ou no fim do período de tratamento crônico, os animais foram mortos por decapitação. Os pulmões foram extraídos e congelados por meio de imersão em nitrogênio líquido. As amostras foram armazenadas a −80°C até a análise. Os pulmões foram pesados e homogeneizados a 1:5 p/v em líquido gelado (1,15% de KCl e 20 mmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonila), por meio de um homogeneizador Ultra-Turrax (IKA, Toronto, ON, Canadá). Para remover a fração particulada, os homogeneizados foram centrifugados a 1.000 g durante 20 min a 0-4°C, e o sobrenadante foi usado para os ensaios de POL, PART e conteúdo proteico.( )

O nível de PART foi determinado por meio da medição da intensidade de quimioluminescência do luminol induzida pela termólise de dicloridrato de 2,2'-azobis(2-amidinopropano).( ) Os resultados foram expressos em µM de ácido 2-carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano por mg de proteína. A POL foi quantificada por meio de quimioluminescência. O método é altamente sensível e capaz de detectar pequenas quantidades de produtos de peroxidação. A quimioluminescência foi medida em um contador de cintilação líquida com o circuito de coincidência desconectado (LKB Rack Beta Liquid Scintillation Spectrometer 1215; LKB Produkter AB, Bromma, Suécia). As reações foram iniciadas por meio da adição de 3 mmol/L de hidroperóxido de terc-butilo, e os dados foram expressos em contagens por segundo por mg de proteína no homogeneizado.( ) Os níveis de proteína foram medidos pelo método de Lowry et al.,( ) e a albumina sérica bovina foi usada como padrão.

Os dados foram estatisticamente avaliados por meio do teste t de Student e estão expressos na forma de média ± ep. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

Primeiramente avaliamos o efeito do tratamento agudo com metilprednisolona sobre os níveis de PART e POL em pulmões de ratos. Foi observado um aumento significativo (de 20%) dos níveis totais de PART no grupo tratado (p < 0,05; Figura 1). Não houve diferença significativa entre os grupos quanto aos níveis de POL (p > 0,05; Figura 2).

Figura 1

Média dos níveis de potencial antioxidante reativo total (PART) nos pulmões de ratos submetidos a administração aguda de metilprednisolona (grupo de tratamento agudo) ou injeção de um volume igual de solução salina (grupo de controle agudo). Trolox: ácido 2-carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano. *p < 0,05, teste t de Student.

Figura 2

Média dos níveis de peroxidação lipídica nos pulmões de ratos submetidos a administração aguda de metilprednisolona (grupo de tratamento agudo) ou injeção de um volume igual de solução salina (grupo de controle agudo). QL: quimioluminescência; e cps: contagens por segundo.

Não encontramos nenhuma diferença entre o grupo de tratamento crônico e o grupo de controle crônico no tocante aos níveis totais de PART (p > 0,05; Figura 3). O grau de dano oxidativo pulmonar, medido por meio de quimioluminescência, foi significativamente (38%) maior no grupo de tratamento crônico do que no grupo de controle crônico (p < 0,05; Figura 4).

Figura 3

Média dos níveis de potencial antioxidante reativo total (PART) nos pulmões de ratos submetidos a administração crônica de metilprednisolona oral (grupo de tratamento crônico) ou não (grupo de controle crônico). Trolox: ácido 2-carboxílico-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano.

Figura 4

Média dos níveis de peroxidação lipídica nos pulmões de ratos submetidos a administração crônica de metilprednisolona oral (grupo de tratamento crônico) ou não (grupo de controle crônico). QL: quimioluminescência; e cps: contagens por segundo. *p < 0,05, teste t de Student

Discussão

As concentrações de antioxidantes nos pulmões podem ser quantificadas por meio da medição do nível de PART.( , ) A concentração relativa de antioxidantes determina a capacidade antioxidante total do tecido. O nível de PART representa principalmente os antioxidantes não enzimáticos solúveis em água no tecido. Além disso, o nível de POL, que desempenha um papel importante na indução de apoptose e formação de radicais livres,( ) é amplamente usado como marcador de estresse oxidativo.

Os resultados do presente estudo mostram que a duração da corticoterapia altera as respostas do sistema oxidativo nos pulmões de ratos. O tratamento agudo com metilprednisolona induziu um aumento significativo dos níveis de PART nos pulmões de ratos sem quaisquer alterações dos níveis de POL. No entanto, quando o tratamento foi mantido por 30 dias, observou-se um aumento dos níveis de POL sem quaisquer alterações dos níveis de PART, o que aumenta o risco de lesão pulmonar oxidativa. Não obstante, quando os animais foram submetidos ao tratamento com uma dose mais baixa de metilprednisolona durante 15 dias, nenhum desses efeitos foi observado (dados não apresentados).

O aumento do potencial antioxidante induzido pela administração de metilprednisolona em curto prazo pode representar um mecanismo de proteção contra a geração de ERO após a exposição a corticosteroides. As ERO podem ser geradas em consequência do metabolismo intracelular de compostos estranhos, toxinas ou drogas pelo sistema enzimático do citocromo P450, bem como em virtude da exposição a fatores ambientais, tais como excesso de sais de ferro ou irradiação UV.( ) Antioxidantes intracelulares, membranas celulares e fluidos extracelulares podem ser suprarregulados e mobilizados a fim de neutralizar a formação excessiva e inadequada de ERO. Para fornecer mecanismos extracelulares de defesa antioxidante, as células epiteliais do trato respiratório sintetizam e secretam várias enzimas antioxidantes, tais como formas extracelulares de superóxido dismutase( ) e glutationa peroxidase,( ) bem como várias proteínas de ligação a metais (como por exemplo a transferrina e a ceruloplasmina) que minimizam o envolvimento de íons de metais de transição (como por exemplo o ferro e o cobre) em reações de oxidação.( ) Além disso, o fluido de revestimento epitelial extracelular também contém vários sistemas antioxidantes não enzimáticos, incluindo a vitamina C (ascorbato) e a vitamina E (alfa-tocoferol).( ) O ensaio de PART empregado no presente estudo é amplamente usado( , , ) e mede principalmente antioxidantes não enzimáticos solúveis em água, como a glutationa, o ácido ascórbico e o ácido úrico. A medição de todos esses antioxidantes é essencial à avaliação do estado antioxidante. No entanto, o número de antioxidantes diferentes em amostras biológicas torna difícil medir cada um separadamente. Além disso, a possível interação entre os diferentes antioxidantes pode fazer com que medidas de antioxidantes individuais sejam menos representativas do que o estado antioxidante geral.( )

Nossos resultados corroboraram os de estudos anteriores, sugerindo que a administração de corticosteroides em curto prazo protege contra a lesão oxidativa em diferentes tecidos em modelos experimentais.( ) Demonstrou-se que a administração de prednisolona e dexametasona em curto prazo inibe a geração de ERO em plaquetas, e há evidências de que os corticosteroides inibem também a fosforilação oxidativa.( ) Por outro lado, constatamos que 30 dias de tratamento com metilprednisolona aumentaram os níveis de POL. O ensaio de quimioluminescência é o método mais fácil e pode ser aplicado a extratos biológicos brutos. Embora sua especificidade tenha sido questionada,( ) esse ensaio em particular é amplamente usado para medições ex vivo e in vitro,( ) e é aceito como uma janela empírica para o exame do complexo processo de POL.( ) O desequilíbrio entre a produção de ERO e as defesas antioxidantes do organismo é chamado estresse oxidativo, que tem grandes implicações para a saúde.( ) Se há ERO demais ou muito poucos antioxidantes para a proteção, ocorre estresse oxidativo, que pode causar danos permanentes.( ) Embora as diferenças não tenham sido significativas, constatamos que a administração de um corticosteroide em longo prazo induziu uma diminuição dos níveis de PART e um aumento dos níveis de POL, o que sugere a ocorrência de estresse oxidativo.

Um dos primeiros e mais importantes componentes da lesão tecidual após a reperfusão de órgãos isquêmicos é a produção de ERO. As principais ERO incluem o radical superóxido, o radical hidroxila e o peróxido de hidrogênio. A lesão induzida por ERO atinge proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, citoesqueleto, membranas celulares e peróxidos lipídicos, resultando em diminuição da função mitocondrial e POL.( ) O dano causado por ERO leva à perda de integridade microvascular e à diminuição do fluxo sanguíneo. Demonstrou-se que a patogênese das várias formas de lesão pulmonar envolve quebra peroxidativa de ácidos graxos poli-insaturados (em virtude dos efeitos sobre a função da membrana); inativação de receptores e enzimas ligados à membrana e aumento da permeabilidade dos tecidos.( ) Há cada vez mais evidências de que os aldeídos, que são gerados endogenamente durante o processo de POL, estejam envolvidos em muitos dos eventos fisiopatológicos relacionados com o estresse oxidativo em células e tecidos.( ) Além de suas propriedades citotóxicas, os peróxidos lipídicos têm sido cada vez mais reconhecidos como sendo importantes na transdução de sinais em diversos eventos importantes na resposta inflamatória pulmonar.( ) ão pulmonar remota em um modelo de isquemia-reperfusão hepatoentérica em coelhos, bem como em outros modelos animais.( )

É importante ressaltar que, ao escolher dois regimes diferentes de administração de metilprednisolona (agudo e crônico), buscamos simular a administração parenteral de doses elevadas, que se pode justificar em casos de emergência, como na asma aguda grave, e uma dose oral moderada, que é usada em circunstâncias menos urgentes em seres humanos. Deve-se ter em mente que o metabolismo da droga é mais rápido em pequenos animais do que em seres humanos, sendo necessárias, portanto, doses maiores.(32) No entanto, o fato de termos usado diferentes doses de medicamentos nos dois tratamentos representa uma limitação do presente estudo, pois constitui uma variável de confusão.

Em suma, nossos resultados sugerem que o uso agudo de corticosteroides é benéfico para o tecido pulmonar, ao passo que o uso crônico não o é. Além disso, constatamos que a administração aguda de metilprednisolona aumentou os níveis de antioxidantes no tecido pulmonar de ratos. Trata-se de um achado importante em virtude do uso desse medicamento em eventos agudos e no transplante pulmonar. Por outro lado, o efeito negativo que o tratamento crônico com metilprednisolona tem sobre a POL pode desempenhar um papel nos mecanismos dos efeitos adversos envolvidos em patologias relacionadas com o uso crônico de glucocorticoides. Futuros estudos com modelos de lesão de isquemia/reperfusão em pulmões de ratos podem elucidar as diferenças entre o uso agudo e crônico de corticosteroides no que tange aos mecanismos pelos quais atuam em certas patologias.