Plasma concentrations of retinol in obese children and adolescents: relationship to metabolic syndrome components.

OBJECTIVE: To evaluate obese children and adolescents' retinol plasma levels and to correlate them with metabolic syndrome components.
METHODS: Cross-sectional study with 61 obese children and adolescents (body mass index Z score - ZBMI>+2). Pubertal development, arterial blood pressure, body weight and height for nutritional classification and waist circumference were obtained. A 15 mL blood sample was collected (after a 12-hour fasting in a low luminosity room) for retinol determination (cut-off inadequate if <30 µg/dL), lipid profile (HDL-c, LDL-c, and triglycerides), oral glucose tolerance test (fasting and 120 minutes) and for high sensitivity C-reactive protein. Spearman correlation and multiple linear regression were used in the statistical analysis.
RESULTS: Mean age was 10.7±2.7 years. There was a predominance of male gender 38/61 (62%) and pre-pubertal 35/61 (57%) subjects. The average plasmatic retinol was 48.5±18.6 ug/dL. Retinol deficiency and severe obesity were observed in 6/61 (10%) and 36/61 (59%), respectively. Glucose level at 120 minutes was the independent and predictive variable of plasma retinol levels [β=-0.286 (95%CI -0.013 - -0.001)].
CONCLUSIONS: An independent and inverse association between plasma retinol levels and glucose tolerance was observed, suggesting an important contribution of this vitamin in the morbidities associated to obesity in children and adolescents.

Introduction

The increased prevalence of obesity in children and adolescents is epidemic in many countries, including Brazil( , ). Data from the Household Budget Service of 2008 show a five-fold increase in the frequency of obesity in children from 5 to 9 years of age in the last 20 years( ). In adolescents, excess weight is observed in 21.7 and 19.4% of boys and girls respectively( ).

Obesity is associated with comorbidities that increase the risk of developing other chronic diseases, such as cardiovascular disease. Insulin resistance and oxidative stress are central mechanisms to explain the morbidities associated with excess weight in the short and long term( ).

Cross-sectional studies conducted in children and adolescents with overweight and obesity reported decreased concentrations of vitamin A( , ). Factors associated with these findings are the reduction in vitamin A intake (food sources), its sequestration in adipose tissue and its increased use in fighting oxidative stress( , ).

It has been recently emphasized the importance of retinol in the metabolism of adipose tissue and in insulin resistance( ). Studies with experimental animals have demonstrated a relationship between lower concentrations of retinol, greater adiposity, and higher blood glucose levels( , ). However, there is still no consensus about this relationship in studies conducted in humans, especially in the pediatric age group( - ).

This study evaluated the plasma concentrations of retinol in obese children and adolescents, relating them to the components of the metabolic syndrome.

Method

Through a cross-sectional study, 61 obese children and adolescents were evaluated (Z score of body mass index - ZBMI>+2), who attended the first consultation between February 2008 and November 2009 in the obesity clinic of the Service of Nutrition at the Department of Pediatrics, School of Medicine of ABC (Faculdade de Medicina do ABC - FMABC).

The research protocol was approved by the Research Ethics Committee of FMABC. Those responsible for children and adolescents signed an informed consent and the consent for inclusion in the study.

The following patients were excluded from the sample: children and adolescents with Z score for height/age (HAZ)<-1.0; those with obesity secondary to diseases; those using immunosuppressive drugs, corticosteroids, and vitamin supplements containing vitamin A in the 6 months preceding the collection; patients with acute diseases (infectious or inflammatory) at the time of collection of tests and/or whose legal guardians did not consent to participation in the study.

For all patients, a standardized questionnaire with demographic and clinical data was administered, and a physical examination and assessment of pubertal stage were performed( ). Measurements of weight and height were obtained for the calculation of anthropometric measures, and the classification of nutritional status according to recommendations of the World Health Organization 2006/2007( ). Patients were classified as obese when ZBMI>+2 and with severe obesity when ZBMI>+3. The waist circumference was obtained at the midpoint between the last rib and the higher iliac crest, and it was used to calculate the waist/height ratio. The ratio values greater than 0.5 were considered high( ). Systemic blood pressure was measured with aneroid sphygmomanometer by a single measure. Values above the 95th percentile were considered high for gender, age, and height( ).

The collection of laboratory exams was performed with the patients fasting for 12 hours, by peripheral venipuncture (15mL of blood) in a room with low light in the Laboratory of Clinical Analysis of FMABC, where the samples were processed and analyzed. Plasma retinol was determined using the HPLC (high-performance-liquid-chromatography)(16) and values lower than 30mg/dL were considered inappropriate (1.05mmol/L)( ). The lipid profile was evaluated (total cholesterol, HDL-c, LDL-c and triglycerides) by the enzymatic and colorimetric method, and for their classification, the cutoff points proposed by the American Academy of Pediatrics were adopted( ). The ultrasensitive C-reactive protein (US-CRP) was determined by chemiluminescence. We also conducted the oral glucose tolerance test with blood sampling to determine blood glucose (colorimetric method) fasting and 120 minutes after oral overload with maltodextrin (75g). The values at 120 minutes lower than 140mg/dL were considered normal; from 140 to 200mg/dL, were considered as glucose intolerance, and higher than 200mg/dL, type 2 diabetes( ).

For statistical analysis, we used the Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), version 20.0. The Mann-Whitney test and Spearman's correlation were applied to compare continuous variables. For qualitative variables, we used the chi-square test. Regarding the multivariate analysis, we used multiple linear regression (stepwise method). The level of significance was set at 5%.

Results

The mean age of children was 10.7±2.7 years and most patients were male, 38/61 (62.3%), and pre-pubescent, 35/61 (57.4%). There were no differences by gender and pubertal stage for the general variables, for retinol concentrations, and for the components of metabolic syndrome (data not shown).

Severe obesity was observed in 36/61 (59%) and all patients presented waist/height >0.5. Associated morbidities were observed with high frequency (Table 1). As for the oral glucose tolerance test, it was verified that 5/61 (8.2%) were intolerant (values at 120 minutes above 140mg/dL). No patient had glucose at 120 minutes higher than 200mg/dL, which characterizes type 2 diabetes.

Table 1

Characteristics of the study population

The mean concentrations of retinol were 48.5±18.6ug/dL and inadequate values were observed in 6/61 (9.8%) of the sample (Table 1). Retinol values were directly associated with age (r=0.298), triglycerides (r=0.256), and HDL-c (r=0.304), and inversely with blood glucose at 120 minutes (r=-0.336). By means of multivariate analysis, it was observed that glucose at 120 minutes was the predictor and independent variable of the concentration of retinol (Table 2).

Table 2

Linear regression between retinol concentrations and lipid profile, systemic blood pressure, blood glucose (fasting and 120 minutes), ultrasensitive C-reactive protein, Z score of body mass index and waist/height ratio

Discussion

The present study described the inverse and independent association between the plasma retinol concentrations and glucose at 120 minutes (glucose intolerance) in obese children and adolescents. Several authors have described the relationship between retinol deficiency and hyperglycemia in experimental models( , ). However, there is no consensus about this relationship in humans( , - ).

Inadequate concentrations of retinol (<30ug/dL) were observed in 9.8% of the assessed population. A similar result was described by Valente da Silva et al ) in a study involving 471 children and adolescents from Rio de Janeiro. In a study by Sarni et al ), a higher frequency of retinol deficiency in obese preschoolers was found (18.2%). The children and adolescents assessed presented a high percentage of severe obesity. There was also a high frequency of associated morbidities, such as changes in fasting glucose and dyslipidemia, despite the low age (10.7±2.7 years) of patients. Dyslipidemia associated with obesity, whose central mechanism is insulin resistance, is characterized by increased levels of triglycerides, decreased levels of HDL-c, and abnormal composition of LDL-c, with a higher proportion of small, dense particles( ). The association between micronutrient deficiencies and obesity is another risk factor for the development of noncommunicable chronic diseases in the future( ).

Vitamin A can be found in the organism under several forms: the circulating form is retinol, retinol esters are the form of deposit; retinal and retinoic acid are the biologically active forms. It is difficult to perform the measurement of the active forms of retinol because they are very labile and occur in low concentrations in tissues. To serve its functions, retinol binds to specific groups of receptors (RARs - retinoic acid receptors e RXRs - retinoid X receptors) present in various tissues( ).

Stored retinol, its active forms, and enzymes related to its metabolism and transport can be found in the adipose tissue( ). Studies have sought to better understand the relationship between retinol, obesity, and insulin resistance. However, the results are controversial in humans( , - ).

Several hypotheses have been raised in experimental studies. The first relates to the involvement of retinoic acid in the proper functioning of the islets of Langerhans( ). The second refers to the role of retinol in modulating circulating levels of leptin (adipokine that acts in the control of satiety) and improving insulin resistance( ). A diet supplemented with vitamin A was related to lower expression of the leptin gene in rodents( ). The third hypothesis involves the action of vitamin A on differentiation and metabolism of the adipose tissue. Animals subjected to diet without retinol evolve with growth impairment and greater adiposity. The supplemental retinol or retinoic acid, in turn, is related to reduced fat mass and improved insulin sensitivity( , ).

In this study, there was no relationship between obesity and retinol concentrations, which were associated only with glucose at 120 minutes. Other studies with similar age range show conflicting results( , , ). Long-term clinical trials with a larger number of subjects included (with and without retinol deficiency), using other measures of body composition, may contribute to better understand this relationship in humans.

A fourth hypothesis in this context involves the role of RBP-4 (retinol binding protein 4) in obesity and glucose intolerance. RBP-4 is a protein that transports retinol and is produced predominantly in the liver. However, it can also be considered an adipokine in situations such as insulin resistance( ). In an interesting study( ), the authors found that a group of mice with insulin resistance (knockout for glucose 4 transporter- GLUT4) showed mRNA expression of RBP-4 2.5 times higher compared to controls and that the administration of rosiglitazone (drug that improves insulin sensitivity) reduced the concentrations of RBP-4. The administration of RBP-4 in normal mice, in turn, led to insulin resistance. The authors concluded that adipocytes can release RBP-4 in the circulation as a sign of glucose intolerance and the treatment of animals with agents that enhance insulin sensitivity may lead to reduced concentrations of RBP-4 and vice versa( ). There are studies in children and adolescents suggesting that RBP-4 can be considered one of the factors related to the morbidities in obesity( , ).

In the present research, the measurement of RBP-4 was not performed, making it impossible to compare the results with others. There is a current proposal for plasma concentrations of retinol to be considered together with those of RBP-4 through the retinol: RPB-4 ratio. Low values of this ratio are more associated with glucose intolerance than the values of RBP-4 isolated( ). In our setting, further studies are needed to assess the retinol:RPB-4 ratio and glucose intolerance in situations like that observed in Brazil - high percentage of obesity( ) and vitamin A deficiency( ), especially in pre-school children.

The inverse and independent association between serum retinol and glucose tolerance suggests the importance of the participation of this vitamin in morbidities associated with obesity in children and adolescents. Nutritional education strategies aiming at the adequate intake of energy, macro and micronutrients, especially those with antioxidant properties, should be implemented in overweight individuals, with the goal of reducing future associated morbidities.

Introdução

O aumento na prevalência de obesidade em crianças e adolescentes ocorre de maneira epidêmica em muitos países, incluindo o Brasil( , ). Dados da Pesquisa de Orçamentos Familiares de 2008 demonstram aumento de cinco vezes na frequência de obesidade em crianças de cinco a nove anos de idade nos últimos 20 anos( ). Em adolescentes, o excesso de peso é observado em 22 e 19% dos meninos e das meninas, respectivamente( ).

A obesidade associa-se a morbidades que elevam o risco de desenvolver outras doenças crônicas não transmissíveis, como as cardiovasculares. A resistência insulínica e o estresse oxidativo são mecanismos centrais para explicar as morbidades associadas ao excesso de peso em curto e longo prazos( ).

Estudos transversais conduzidos com crianças e adolescentes com sobrepeso e obesidade relatam redução das concentrações de vitamina A( , ). Os fatores associados a esses achados são a redução no consumo de vitamina A (alimentos-fonte), seu sequestro no tecido adiposo e sua maior utilização no combate ao estresse oxidativo( , ).

Recentemente, tem sido enfatizada a importância do retinol no metabolismo do tecido adiposo e na resistência insulínica( ). Estudos com animais de experimentação demons-tram relação entre menores concentrações de retinol, maior adiposidade e maiores níveis glicêmicos( , ). Entretanto, ainda não há consenso acerca dessa relação em estudos conduzidos em humanos, especialmente na faixa etária pediátrica( - ).

Este estudo avaliou as concentrações plasmáticas de retinol em crianças e adolescentes obesos, relacionando-as aos componentes da síndrome metabólica.

Método

Por meio de estudo transversal, avaliaram-se 61 crianças e adolescentes obesos (escore Z do índice de massa corpórea - ZIMC>+2), que compareceram para a primeira consulta entre fevereiro de 2008 e novembro de 2009 no ambulatório de obesidade do Serviço de Nutrologia do Departamento de Pediatria da Faculdade de Medicina do ABC (FMABC).

O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da FMABC. Os responsáveis pelas crianças e pelos adolescentes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido e o de assentimento para a inclusão no estudo.

Excluíram-se as crianças e os adolescentes com escore Z de estatura/idade (ZEI)<-1,0; aqueles com obesidade secundária a doenças; os que utilizavam medicamentos imunossupressores, corticoterapia e suplementos vitamínicos contendo vitamina A nos seis meses que precederam a coleta; os portadores de doenças agudas (infecciosas ou inflamatórias) no momento da coleta dos exames e/ou cujos responsáveis não consentiram a participação no estudo.

Para todos os pacientes incluídos, aplicou-se um questionário padronizado com dados demográficos e clínicos e realizaram-se exame físico e avaliação do estadiamento puberal( ). Obtiveram-se as medidas de peso e estatura para o cálculo dos índices antropométricos e a classificação da condição nutricional segundo a recomendação da Organização Mundial da Saúde 2006/2007( ). Considerou-se obesidade quando ZIMC>+2 e obesidade grave quando ZIMC>+3. A cintura abdominal foi obtida no ponto médio entre a última costela fixa e a crista ilíaca superior, sendo utilizada para calcular a relação cintura/altura. Os valores da relação superiores a 0,5 foram considerados elevados( ). Aferiu-se a pressão arterial sistêmica com esfigmomanômetro aneroide por meio de medida única. Consideraram-se elevados os valores acima do percentil 95 para gênero, idade e estatura( ).

A coleta dos exames laboratoriais foi realizada com os pacientes em jejum de 12 horas, por venopunção periférica (15mL de sangue) em sala de baixa luminosidade no Laboratório de Análises Clínicas da FMABC, onde as amostras foram processadas e analisadas. O retinol plasmático foi dosado utilizando-se a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, do inglês high-performance-liquid-chromatography)(16) e consideraram-se inadequados os valores inferiores a 30mg/dL (1,05mmol/L)( ). Avaliou-se o perfil lipídico (colesterol total, HDL-c, LDL-c e triglicérides) pelo método colorimétrico e enzimático e, para sua classificação, adotaram-se os pontos de corte propostos pela Academia Americana de Pediatria( ). A proteína C-reativa ultrassensível (PCR-US) foi determinada por quimioluminescência. Realizou-se também o teste de tolerância oral à glicose com coleta de sangue para determinar a glicemia (método colorimétrico) de jejum e de 120 minutos após a sobrecarga oral com maltodextrina (75g). Os valores aos 120 minutos menores do que 140mg/dL foram considerados normais; de 140 a 200mg/dL, foram considerados como intolerância à glicose e maiores do que 200mg/dL, diabetes tipo 2( ).

Para a análise estatística, utilizou-se o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS), versão 20.0. Aplicaram-se o teste de Mann-Whitney e a correlação de Spearman para a comparação entre as variáveis contínuas. Para as variáveis qualitativas, utilizou-se o teste do quiquadrado. Quanto à análise multivariada, empregou-se a regressão linear múltipla (método stepwise). O nível de significância adotado foi de 5%.

Resultados

A média de idade das crianças estudadas foi de 10,7±2,7 anos e a maioria dos pacientes era do sexo masculino 38/61 (62%) e pré-púberes 35/61 (57%). Não houve diferenças quanto ao gênero e ao estadiamento puberal para as variáveis gerais, para as concentrações de retinol e para os componentes da síndrome metabólica (dados não mostrados).

Observou-se obesidade grave em 36/61 (59%) e todos os pacientes apresentaram relação cintura/altura >0,5. Morbidades associadas foram verificadas com frequência elevada (Tabela 1). Quanto ao teste de tolerância oral à glicose, verificou-se que 5/61 (8%) apresentaram intolerância (valores aos 120 minutos acima de 140mg/dL). Nenhum paciente apresentou glicemia aos 120 minutos superior a 200mg/dL, o que caracterizaria diabetes tipo 2.

Tabela 1

Caracterização da população estudada

A média das concentrações de retinol foi de 48,5±18,6ug/dL e valores inadequados foram observados em 6/61 (10%) da população estudada (Tabela 1). Os valores de retinol associaram-se diretamente com idade (r=0,298), triglicérides (r=0,256) e HDL-c (r=0,304) e inversamente com os valores de glicemia aos 120 minutos (r=-0,336). Por meio da análise multivariada, observou-se que a glicemia aos 120 minutos foi a variável preditora e independente da concentração de retinol (Tabela 2).

Tabela 2

Regressão linear entre as concentrações de retinol e perfil lipídico, pressão arterial sistêmica, valores de glicemia (jejum e 120 minutos), proteína C-reativa ultrassensível, escore Z do índice de massa corpórea e relação cintura/altura

Discussão

O presente estudo descreveu a associação inversa e independente entre as concentrações plasmáticas de retinol e a glicemia de 120 minutos (intolerância à glicose) em crianças e adolescentes obesos. Vários autores descreveram a relação entre a deficiência de retinol e a hiperglicemia em modelos experimentais( , ). Entretanto, não há consenso acerca dessa relação em humanos( , - ).

Observaram-se concentrações inadequadas de retinol (<30ug/dL) em 10% da população avaliada. Resultado semelhante foi descrito por Valente da Silva et al ) em estudo envolvendo 471 crianças e adolescentes da cidade do Rio de Janeiro. Em estudo conduzido por Sarni et al ), descreveu-se maior frequência de deficiência de retinol em pré-escolares obesos (18%). As crianças e adolescentes avaliados apresentaram elevado percentual de obesidade grave. Verificou-se também elevada frequência de morbidades associadas, como alteração da glicemia de jejum e dislipidemia, apesar da baixa idade (10,7±2,7 anos) dos pacientes avaliados. A dislipidemia associada à obesidade, cujo mecanismo central é a resistência insulínica, caracteriza-se por aumento dos níveis de triglicerídeos, queda nos níveis de HDL-c e composição anormal de LDL-c, com maior proporção de partículas pequenas e densas( ). A associação entre carência de micronutrientes e obesidade é um fator de risco a mais para se desenvolverem doenças crônicas não transmissíveis no futuro( ).

A vitamina A pode ser encontrada no organismo sob diversas formas: o retinol é a forma circulante; os ésteres de retinol são a forma de depósito; o retinal e o ácido retinoico são as formas biologicamente ativas. É difícil realizar a dosagem das formas ativas de retinol por serem muito lábeis e ocorrerem em baixas concentrações nos tecidos. Para exercer suas funções, o retinol se liga a grupos específicos de receptores (RARs - retinoic acid receptors e RXRs - retinoid X receptors) presentes em diversos tecidos( ).

No tecido adiposo, pode-se encontrar retinol armazenado, suas formas ativas e as enzimas relacionadas ao seu metabolismo e transporte( ). Estudos têm buscado compreender melhor a relação entre retinol, obesidade e resistência insulínica. Entretanto, os resultados em humanos são controversos( , - ).

Algumas hipóteses têm sido levantadas em estudos experimentais. A primeira relaciona-se à participação do ácido retinoico no adequado funcionamento das ilhotas de Langerhans( ). A segunda refere-se ao papel do retinol na modulação dos níveis circulantes de leptina (adipocitocina, que atua no controle da saciedade) e na melhora da resistência à insulina( ). A dieta suplementada em vitamina A relacionou-se com menor expressão do gene da leptina em roedores( ). A terceira hipótese envolve a ação da vitamina A na diferenciação e no metabolismo do tecido adiposo. Animais submetidos à dieta isenta de retinol evoluem com prejuízo no crescimento e com maior adiposidade. A suplementação de retinol ou ácido retinoico, por sua vez, relaciona-se com redução da massa gorda e melhora da sensibilidade à insulina( , ).

Neste estudo, não houve relação entre obesidade e concentrações de retinol, as quais se associaram somente com a glicemia aos 120 minutos. Outros estudos com faixa etária semelhante à adotada neste trabalho mostram resultados conflitantes( , , ). Ensaios clínicos de longa duração, com maior número de indivíduos incluídos (com e sem deficiência de retinol), utilizando outras medidas de composição corporal, podem contribuir para entender melhor essa relação em humanos.

Uma quarta hipótese levantada nesse contexto envolve o papel da RBP-4 (retinol binding protein 4) na obesidade e na intolerância à glicose. A RBP-4 é uma proteína que transporta retinol e é produzida predominantemente no fígado. Entretanto, também pode ser considerada uma adipocitocina em situações como a resistência insulínica( ). Em um interessante estudo( ), os autores observaram que um grupo de camundongos com resistência insulínica (knockout para o transportador de glicose 4 - GLUT4) apresentava expressão de RNA mensageiro da RBP-4 2,5 vezes mais elevada comparativamente a controles e que a administração de rosiglitazone (medicamento que melhora a sensibilidade à insulina) reduzia as concentrações de RBP-4. A administração de RBP-4 em camundongos normais, por sua vez, levava à resistência insulínica. Os autores concluíram que os adipócitos podem liberar RBP-4 na circulação como um sinal de intolerância à glicose e o tratamento dos animais com agentes que melhoram a sensibilidade à insulina pode levar à redução das concentrações de RBP-4 e vice-versa( ). Há estudos com crianças e adolescentes sugerindo a RBP-4 como um dos fatores relacionados às morbidades presentes na obesidade( , ).

Na presente pesquisa, não foi feita a dosagem de RBP-4, o que impossibilita a comparação dos resultados obtidos com outros disponíveis. Há uma proposta atual para que as concentrações plasmáticas de retinol sejam consideradas em conjunto com as de RBP-4 por meio da relação retinol:RPB-4. Valores baixos dessa relação estão mais associados à intolerância à glicose do que os valores de RBP-4 isolados( ). São necessários novos estudos que avaliem a relação retinol: RPB-4 e intolerância à glicose em situações como a observada no Brasil - elevado percentual de obesidade( ) e de deficiência de vitamina A( ), especialmente em pré-escolares.

A associação independente e inversa entre retinol plasmático e tolerância à glicose sugere a importância da participação dessa vitamina nas morbidades associadas à obesidade em crianças e adolescentes. Estratégias de educação nutricional, visando ao consumo adequado de energia, macro e micronutrientes, especialmente aqueles com propriedades antioxidantes, devem ser implementadas em indivíduos com excesso de peso, tendo como meta a redução futura de morbidades associadas.