Accuracy of the QuantiFERON-TB Gold in Tube for diagnosing tuberculosis in a young pediatric population previously vaccinated with Bacille Calmette-Guérin .

OBJECTIVE: To evaluate the accuracy of an interferongamma release assay (QuantiFERON-TB Gold in Tube) for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection in a young pediatric population.
METHODS: 195 children previously vaccinated with BCG were evaluated, being 184 healthy individuals with no clinical or epidemiological evidence of mycobacterial infection, and 11 with Mycobacterium tuberculosis infection, according to clinical, radiological, and laboratory parameters. A blood sample was obtained from each child and processed according to the manufacturer's instructions. The assay performance was evaluated by a Receiver Operating Characteristic (ROC) curve.
RESULTS: In the group of 184 non-infected children, 130 (70.6%) were under the age of four years (mean age of 35 months). In this group, 177 children (96.2%) had negative test results, six (3.2%) had indeterminate results, and one (0.5%) had a positive result. In the group of 11 infected children, the mean age was 58.5 months, and two of them (18%) had negative results. The ROC curve had an area under the curve of 0.88 (95%CI 0.82-0.92; p<0.001), disclosing a predictive positive value of 81.8% for the test (95%CI 46.3-97.4). The assay sensitivity was 81.8% (95%CI 48.2-97.2) and the specificity was 98.8% (95%CI 96-99.8).
CONCLUSIONS: In the present study, the QuantiFERON-TB Gold in Tube performance for diagnosing M. tuberculosis infection was appropriate in a young pediatric population.

Introduction

The 2012 World Health Organization Global Report estimated that 83,000 new cases of tuberculosis occur each year in Brazil with 5,600 deaths( ). Children infected with Mycobacterium tuberculosis are more prone to develop disease, especially those younger than 5 years, who are at increased risk of developing disseminated forms of tuberculosis( ). To decrease the burden of disease, patients with tuberculosis and latent tuberculosis infection need to be identified and treated( ). However, the accurate diagnosis of Mycobaterium tuberculosis infection in children remains troublesome( ). It is usually based on epidemiological data, compatible symptoms, radiologic findings, the presence of a positive tuberculin skin test (TST), and more rarely on culture results due to the scarcity of bacteria in childhood tuberculosis( ).

In Brazil, the National Immunization Program recommends the Bacille Calmette-Guérin (BCG) vaccination during the first month of life, and in this age group the vaccination coverage is higher than 95%( ). The administration of the BCG vaccine in early childhood difficult the interpretation of a posterior tuberculin skin test and limits its utilization as a tool for the diagnosis of tuberculosis in younger children( ). Due to the great difficulty to diagnosing tuberculosis in children, the Brazilian Ministry of Health developed a scoring system based on clinical, radiological and epidemiological data, such as the household contact with adults presenting active infection, TST test results, and in a small number of cases, the finding of bacilli-positive smears and culture results. In cases of extra-pulmonary tuberculosis, other parameters such as biopsies, biochemical and serological tests may be considered. The interpretation of the scoring system is: up to 25 points, tuberculosis is unlikely; from 30 to 35 points tuberculosis is possible, and above 40 points, tuberculosis is very likely. This scoring system has achieved sensitivity levels ranging from 58 to 88.9%, and specificity of 86.5 to 98%( , ).

Laboratory assays based on the quantitation of interferon gamma (IFN-γ) release were developed in order to replace the tuberculin skin test for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection. They are based on the observation that infection by mycobacteria induces a strong Th1 immune response( - ).

The comparison of different mycobacterial genomes led to the identification of a differential region (RD1) that is present in Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis, but is absent in BCG due to multiple passages in culture that the vaccine strain has experienced. The antigens encoded by this region form the basis of tests that measure the secretion of IFN-γ by T lymphocytes and which do not cross-react with BCG( , - ). In humans, two antigens were studied in greater detail, the Secretory Early Target 6 (ESAT-6) and the Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10). The ESAT-6 antigen is encoded and expressed by Mycobacterium tuberculosis, but is absent in BCG and other mycobacteria, excepting M. kansasii, M. szulgai and M. marinum. CFP-10 is a specific protein from Mycobacterium tuberculosis , - ). Currently, there are two commercial tests using a combination of ESAT-6 and CFP-10, based on a SPOT enzyme immunoassay technique (ELISPOT) called T-SPOT-TB (Oxford Immunotech, Abingdon, UK), or on an enzyme immune assay (QuantiFERON-TB Gold in Tube, Cellestis, Carnegie, Australia). The first kit was approved for use in Europe, and the second one in the USA for diagnosing either active or latent tuberculosis.

New diagnostic methods based on detection of IFN-γ released by T cells after in vitro exposure to specific Mycobacterium tuberculosis antigens offer potential advantages for the diagnosis of tuberculosis in children in comparison with TST, as the second generation of tests are not affected by previous BCG vaccination, and they do not require a second visit to determine the test result( , ). Nevertheless, some results are conflicting and there is limited information on the performance of these new tests in Brazilian pediatric patients( , ).

The aim of this study was to determinate the accuracy of a second generation IFN-γ release assay (QuantiFERON-TB Gold in Tube, Cellestis, Carnegie, Australia) for diagnosing Mycobacterium tuberculosis infection in a young pediatric population previously vaccinated with BCG.

Method

This study was approved by the Research Review Board of the University of São Paulo. Children previously vaccinated with BCG who attended the clinical laboratory of the Instituto da Criança (Child's Institute) do Hospital das Clínicas for routine blood sampling were included in the control group, after the informed consent of parents or legal guardians were obtained. Parents were thoroughly inquired on the children's possible domiciliary contact with contagious tuberculosis patients, signs or symptoms compatible with tuberculosis, and previous BCG vaccination. Children with history of contact with a person with known or suspected tuberculosis, children who presented signs or symptoms compatible with the disease, those without a BCG scar or having any immune system disorder were excluded from the study.

Children referred to four different hospitals of the city of São Paulo with a recent diagnosis of Mycobacterium tuberculosis infection were allocated in the infected group before the beginning of treatment. An informed consent was also obtained from parents or legal guardians. The initial diagnosis of tuberculosis infection was made by each child's paediatrician. For the purposes of this study, children with definite and probable Mycobacterium infection were included as a tuberculosis case if they had a) a positive microbiological identification of Mycobacterium tuberculosis, either by bacilli observation on sputum smear or by standard culture isolation or b) a close contact with a bacilliferous adult presenting a Tuberculin Skin Test of 20 mm or more, with clinical or radiological abnormalities compatible with tuberculosis, and these children should have scored at least 40 points when evaluated by the diagnostic scoring system adopted by the Ministry of Health, Brazil( , ). Children diagnosed as having a tuberculosis infection by the primary physician, presenting a close contact with a baciliferous adult, with a positive tuberculin skin test, without unequivocal clinical or radiological abnormalities, for whom isoniazid prophylaxis was initiated based on hospital protocols, were also included in this study. Children who were already on treatment or chemoprophylaxis at the time of evaluation were not included in this study. A blood sample was obtained from each child enrolled in the study.

We performed the QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QTF) assay according to the manufacturer's instructions. Briefly, blood was collected and directly transferred into three separate tubes: the negative control tube containing only heparin, the positive control tube containing phytohemagglutinin as a mitogen, and a third tube containing M. tuberculosis-specific peptides ESAT-6, CFP-10 and TB7.7 (Rv2654). The tubes were incubated at 37ºC for 18 hours, centrifuged to obtain plasma samples which were stored at -20ºC until the ELISA test was performed. A calibration curve was plotted with the absorbance values (OD) defined by the IFN-γ produced in the three control tubes: with mitogen, negative control and with specific M. tuberculosis-antigens. Thereafter, the patients' samples OD were measured and the corresponding levels of IFN-γ were calculated by means of the specific Cellestis software. Absolute values of IFN-γ were calculated by subtracting the OD of the tube with mitogens and the negative control from the absorbance of the tube containing M. tuberculosis-antigens. The result was considered indeterminate when the IFN-γ value of the negative control tube was ≥8.0IU/mL or the value after the subtraction of the negative-tube value from the mitogen-containing tube value was <0.5IU/mL.

The statistical software MedCalc(r) version 10.1.2 was used to obtain a Receiver Operating Characteristic Curve (ROC curve). The best cut-off value of the absolute IFN-γ level after stimulation by specific antigens was determined. The sensitivity, specificity, positive and negative predictive values of the newly established cut-off were calculated. The area under the curve (AUC) was used to assess the predictive accuracy of the test.

Results

From April to July 2008, 184 children with no clinical and epidemiological evidence of M. tuberculosis infection were enrolled in the study. There were 110 boys (59.7%), the mean age was 35 months, the median age was 35 months (3 months to 71 months). Six children (3.2%), all of them under the age of four, had an indeterminate result due to low mitogen responses. A second blood sample from these children to confirm these results was not obtained. One child (0.5%) with 23 months of age had an absolute IFN-γ value after stimulation with specific antigens higher than 0.35IU/mL. This result was interpreted as being positive according to the manufacturer suggested cut-off for the test. This child remained in ambulatory follow-up and, after 10 months, did not show any clinical or radiological abnormalities suggestive of infection with Mycobacterium tuberculosis, or had not any household contact identified with the disease. For the purposes of this study, this patient was considered as having a false positive result. The remaining 177 children (96.2%) had negative test results.

Eleven children with M. tuberculosis infection were selected, 4 boys (37%) and 7 girls (63%). The mean age was 58.5 months (8 to 132 months). Six children were diagnosed as having latent tuberculosis infection, 3 children had pulmonary disease, one child had M. tuberculosis meningitis and one child had M. tuberculosis pericarditis. Two children out of 11 had an absolute IFN-γ concentration after specific antigen stimulation <0.35IU/mL so that these two test results were interpreted as being negative. One of these children was an eight months old boy with pulmonary disease, with clinical and radiological persistent abnormalities, a highly positive TST (23mm), but with negative sputum smear and culture for M. tuberculosis. The other QTF-negative child was a 31 months old girl with pulmonary disease, with clinical and radiological persistent abnormalities and positive M. tuberculosis sputum culture (Table 1). Treatment with three drugs was indicated for both children.

Table 1

Clinical characteristics of children considered infected with Mycobacterium tuberculosis

The six children with indeterminate test results were excluded to plot the receiver operating characteristic (ROC) curve. The ROC curve (Figure 1) determined an area under the curve of 0.876 (95%CI 0.82-0.92; p<0.001), so that 0.305IU/mL was established as the ideal cut-off for this population. This newly determined cut-off value is similar to that proposed by the manufacturer (0.350IU/mL), unlike other studies that recommended a much lower cut off (0.2IU/mL) in immune competent adult patients with active and untreated pulmonary tuberculosis( ). For this absolute IFN-γ concentration, the assay sensitivity found in the present study was 81.8% (95%CI 48.2-97.2) and the specificity was 98.8% (95%CI 96.0-99.8), meeting the requirements of the World Health Organization (WHO) regarding the sensitivity and specificity of immunological methods (greater than 80% and 95%, respectively). The positive predictive value was 81.8% (95% CI: 46.3-97.4), and the negative predictive value was 98.9% (95%CI 96.0-99.8).

Figure 1

Receiver operating characteristic curve for the absolute value of IFN-γ after specific TB-antigen stimulation

Discussion

Interferon-γ release assays constitute an alternative for the diagnosis of latent infection in adults, as it is more accurate than TST( ). Only a few studies have evaluated the use of QFT in children, but the characteristics of the study populations are often heterogeneous. In two recent meta-analyses( , ), the authors found that the overall accuracy of the QTF-G for the diagnosis of tuberculosis in children was good. In the review by Mandalakas( ), HIV coinfected or immunocompromised children were not excluded. For the assessment of sensitivity, definite (microbiologically confirmed) and probable tuberculosis was accepted. The authors found 17 studies that focused on the QTF-G sensitivity, with a pooled sensitivity of 83% (95%CI 75-92). For the assessment of QFT-G specificity six studies were selected with a pooled specificity of 91% (95%CI 78-100). Sun et al ) found nine studies assessing the QTF-G sensitivity for the diagnosis of active tuberculosis, resulting in a pooled sensitivity of 70% (95%CI 65-75), and when only culture-confirmed tuberculosis cases were considered, the pooled sensitivity increased to 85%. They also found three studies assessing specificity, with a pooled specificity of 100% (95%CI 84-100) for QTF-G. For this meta-analysis, participants coinfected with HIV or other immune compromises and those who had received anti-tuberculosis treatment were excluded. It was also evident that the prevalence of tuberculosis in different settings may alter the performance of the assay, therefore justifying QFT-G evaluation in different populations( , , ). The great heterogeneity of studies with children makes them very difficult to compare. The population of our study represents more closely the conditions encountered in daily practice in our country: all children in our study had received BCG immunization and they were exposed to similar epidemiological conditions. In these conditions, our study found both, sensitivity and specificity of the test similar to those reported in the above mentioned meta-analyses.

QTF-G response is based on the release of IFN-γ by T lymphocytes previously sensitized with M. tuberculosis after exposure to two proteins present in the bacterial cell wall: ESAT-6 and CFP-10. Because these antigens are absent in BCG and most of the mycobacteria present in the environment, previous exposure to these bacteria and immunization with BCG does not induce a positive test result( , - ). In our study, all 184 children from the negative control group received the BCG vaccine, confirmed by the presence of scar. The median and the mean age were 35 months, not far from the recommended period for BCG immunization, and potentially more prone to interfere with the QTF-G test result due to recent vaccination. In the control group, all children but one had a negative QTF-G result, reinforcing the finding that immunization with BCG does not significantly interfere with the second generation QTF-G test results.

The rate of indeterminate results varies among different reports, raising a concern for a possible limitation of QTF-G use in children. Connell et al ) found 6% of indeterminate results, of which 4% were due to inadequate mitogen control values. Bergamini et al tested 315 children by QFT-G, and a higher rate of indeterminate results was found (21.5%), mainly in children under the age of four. The authors also reported that the concentration of mitogen-induced IFN-γ response had significantly increased with age. In another report, Lighter et al ) found a much lower rate of indeterminate results (1.5%) and, although the amount of IFN-γ released after stimulation with the mitogen was directly correlated with age, surprisingly, the proportion of indeterminate results was similar for all age groups. In the present study, we found indeterminate results in six children (3.2%), all of them under the age of four. Although this percentage seems not to have affected the QTF-G performance, in these cases it is advisable to repeat the test in a second sample, especially in young children. Due to the present study design, the evaluation of a second sample was not possible.

By means of a ROC curve, the best cut-off value for the studied population was 0.305UI/mL, very similar to the one recommended by the QFT-G manufacturer (0.350UI/mL). It is important to highlight that even in a young paediatric population the recommended cut off was the same as in adults.

Diagnosing tuberculosis in children is a very difficult task, and available tools are yet far from the ideal. In the present study, the performance of QuantiFERON-TB Gold in Tube for diagnosing M. tuberculosis infection in a predominant young paediatric population was appropriate. The main findings of this study were the high negative predictive value of the test, a useful parameter for the exclusion of tuberculosis in clinical practice, therefore reducing the prescription of unnecessary chemotherapy in children, and the surprisingly low percentage of indeterminate results (3.2%). Nevertheless, the sensitivity of 81.8%, although meeting the WHO criteria of at least 80%, does not recommend the QuantiFERON-TB Gold in Tube as a single laboratory parameter to define tuberculosis in children.

Introdução

O relatório Estatísticas Mundiais de Saúde 2012, da Organização Mundial da Saúde, estima que 83 mil novos casos de tuberculose ocorram a cada ano no Brasil, com 5.600 mortes( ). Crianças infectadas pelo Mycobacterium tuberculosis têm maior risco de desenvolver a doença, especialmente aquelas com menos de cinco anos, que com maior frequência apresentam formas disseminadas da tuberculose( ). Para diminuir o impacto da doença, é necessário identificar e tratar os pacientes com tuberculose e infecção latente pela micobactéria( ). No entanto, o diagnóstico preciso da infeção por Mycobaterium tuberculosis em crianças permanece difícil( ), geralmente baseado em dados epidemiológicos, sintomas compatíveis, achados radiológicos, presença de um teste cutâneo tuberculínico positivo (TST, do inglês tuberculin skin test) e, mais raramente, nos resultados de cultura devido à escassez de bactérias na tuberculose da criança( ).

No Brasil, o Programa Nacional de Imunizações recomenda a vacinação com o Bacille Calmette-Guérin (BCG) durante o primeiro mês de vida e, nesse grupo etário, a cobertura vacinal é superior a 95%( ). A administração da vacina BCG na infância dificulta a interpretação do teste tuberculínico realizado posteriormente e limita sua utilização como uma ferramenta para o diagnóstico da tuberculose em crianças pequenas( ). Devido à grande dificuldade para o diagnóstico da tuberculose em crianças, o Ministério da Saúde desenvolveu um sistema de pontuação baseado em características clínicas, radiológicas e dados epidemiológicos, tais como o contato domiciliar com adultos que apresentam infecção ativa, os resultados do teste de TST e, em um número menor de casos, os achados positivos nos testes de baciloscopia e cultura. Nos casos de tuberculose extrapulmonar, outros parâmetros, como biópsias, exames bioquímicos e serológicos, podem ser considerados. A interpretação do sistema de pontuação é: até 25 pontos, a tuberculose é improvável; de 30 a 35, é possível; e acima de 40 pontos, é muito provável. Esse sistema de pontuação alcançou níveis de sensibilidade de 58 a 88,9% e de especificidade de 86,5 a 98%( , ).

Os ensaios de laboratório baseados na liberação de interferon-gama (IFN-γ) foram desenvolvidos a fim de substituir o TST no diagnóstico de infecção por Mycobacterium tuberculosis. Eles baseiam-se na observação de que a infecção por micobactérias induz uma forte resposta imune do tipo Th1( - ).

A comparação de genomas de diferentes micobactérias levou à identificação de uma região diferencial (RD1) que está presente no Mycobacterium tuberculosis e no Mycobacterium bovis, mas está ausente na BCG devido às múltiplas passagens que a cepa utilizada para a vacina sofreu. Os antígenos codificados por essa região formam a base dos testes que medem a secreção de IFN-γ pelos linfócitos T e que não reagem de forma cruzada com BCG( , - ).Nos seres humanos, dois antígenos foram estudados em maior detalhe, o Early Secretory Target 6 (ESAT-6) e o Culture Filtrate Protein 10 (CFP-10). O ESAT6 é um antígeno codificado e expresso pelo Mycobacterium tuberculosis, mas está ausente no BCG e em outras micobactérias, exceto no M. kansasii, no M. szulgai e no M. marinum. A CFP-10 é uma proteína específica do Mycobacterium tuberculosis , - ). Atualmente, existem dois testes no mercado usando uma combinação de ESAT-6 e CFP-10, baseados em uma técnica de ensaio imunoenzimático SPOT (ELISPOT) chamada T-SPOT-TB (Oxford Immunotec, Abingdon, UK), ou em um ensaio imunoenzimático (QuantiFERON-TB Gold in Tube, Cellestis, Carnegie, Australia). O primeiro kit foi aprovado para uso na Europa e o segundo, nos Estados Unidos, para diagnosticar tuberculose ativa ou latente.

Os métodos baseados na detecção de IFN-γ, liberados pelas células T após exposição in vitro aos antígenos específicos do Mycobacterium tuberculosis, oferecem vantagens potenciais para o diagnóstico da tuberculose em crianças em comparação com o TST: a segunda geração de testes não é afetada pela vacinação prévia com o BCG e não exigem uma segunda visita para determinar o resultado do teste( , ). No entanto, alguns resultados são conflitantes e há poucas informações sobre o desempenho desses novos testes em pacientes pediátricos brasileiros( , ).

O objetivo deste estudo foi determinar a acurácia de uma segunda geração do ensaio de liberação de IFN-γ (QuantiFERON-TB Gold in Tube, Cellestis, Carnegie, Austrália) para o diagnóstico de infecção por Mycobacterium tuberculosis em uma população pediátrica previamente vacinada com BCG.

Método

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade de São Paulo. Crianças previamente vacinadas com BCG que compareceram ao laboratório clínico do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas para coleta de sangue de rotina foram incluídas no Grupo Controle, após o consentimento informado dos pais ou responsáveis legais. Os pais foram inquiridos minuciosamente sobre possível contato domiciliar das crianças com pacientes com tuberculose, sinais e sintomas compatíveis com a doença e vacinação prévia com BCG. Crianças com história de contato com uma pessoa com tuberculose conhecida ou suspeita, que apresentavam sinais e sintomas compatíveis com a doença, sem uma cicatriz do BCG ou com qualquer distúrbio do sistema imunológico foram excluídas do estudo.

Crianças encaminhadas para quatro hospitais diferentes na cidade de São Paulo com diagnóstico recente de infecção por Mycobacterium tuberculosis foram recrutadas para o grupo de pacientes infectados, antes do início do tratamento. Um consentimento informado também foi obtido dos pais ou responsáveis legais. O diagnóstico inicial de infecção tuberculosa foi feito pelo pediatra de cada criança. Para os fins deste estudo, as crianças com infecção definitiva e provável por Mycobacterium foram incluídas como caso de tuberculose se elas tivessem: a) identificação microbiológica positiva de Mycobacterium tuberculosis, seja por observação de bacilos no escarro, seja por isolamento em cultura padrão, ou b) contato próximo com um adulto bacilífero e apresentando teste tuberculínico de 20mm ou mais, com alterações clínicas ou radiológicas compatíveis com tuberculose; essas crianças deveriam ter marcado pelo menos 40 pontos quando avaliadas pelo sistema de pontuação de diagnóstico adotado pelo Ministério da Saúde( , ). As crianças diagnosticadas como tendo uma infecção tuberculosa pelo primeiro médico, apresentando contato próximo com um adulto bacilífero, com teste tuberculínico positivo, sem alterações clínicas ou radiológicas inequívocas, para quem a profilaxia com isoniazida foi iniciada com base em protocolos hospitalares, também foram incluídas neste estudo. As crianças que já estavam em tratamento ou quimioprofilaxia no momento da avaliação não foram incluídas. Uma amostra de sangue foi obtida de cada criança registrada na pesquisa.

Realizou-se o teste QuantiFERON-TB Gold In Tube (QTF-G) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o sangue foi coletado diretamente em três tubos separados: o tubo de controle negativo contendo apenas heparina, o tubo de controle positivo contendo fitohemaglutinina como mitógeno e um terceiro tubo contendo peptídeos específicos para M. tuberculosis ESAT-6, CFP-10 e TB7.7 (Rv2654). Os tubos foram incubados a 37°C durante 18 horas e centrifugados para se obterem amostras de plasma, as quais foram armazenadas a -20°C até o teste ELISA ser realizado. Representou-se graficamente uma curva de calibração com os valores de absorbância (densidade óptica - DO) definidos pelo IFN-γ produzido nos três tubos de controle: com mitógeno, controle negativo e com antígenos específicos para M. tuberculosis. Em seguida, a densidade óptica das amostras dos pacientes foi mensurada e os níveis correspondentes de IFN-γ foram calculados por meio do software específico Cellestis. Os valores absolutos do IFN-γ foram calculados subtraindo-se a absorbância do tubo com mitógenos e controle negativo da absorbância do tubo contendo antígenos para M. tuberculosis. Considerou-se o resultado indeterminado quando o valor do IFN-γ do controle negativo foi ≥8,0UI/mL ou o valor após a subtração do valor do tubo de controle negativo do tubo contendo mitógeno foi <0,5UI/mL.

O software estatístico MedCalc(r), versão 10.1.2, foi usado para se obter uma curva de características operacionais (ROC, do inglês Receiver Operating Characteristic). Determinou-se o melhor valor de corte do nível de IFN-γ absoluto após estimulação por antígenos específicos. Calcularam-se os valores de sensibilidade, especificidade e os valores preditivos positivo e negativo do novo ponto de corte. Utilizou-se a área sob a curva (AUC) para avaliar a acurácia do teste.

Resultados

De abril a julho de 2008, 184 crianças sem evidências clínicas e epidemiológicas da infecção pelo M. tuberculosis foram incluídas no estudo. Havia 110 meninos (59,7%), a idade média foi de 35 meses e a mediana, de 35 meses (três a 71 meses). Seis crianças (3,2%), todas com idade inferior a quatro anos, tiveram um resultado indeterminado devido à baixa resposta ao mitógeno. Não se obteve uma segunda amostra de sangue dessas crianças para confirmar esses resultados. Uma criança (0,5%) com 23 meses de idade obteve um valor absoluto de IFN-γ, após estimulação com antígenos específicos, maior que 0,35UI/mL. Interpretou-se esse resultado como positivo, de acordo com o ponto de corte sugerido pelo fabricante para o teste. A criança permaneceu em acompanhamento ambulatorial e, depois de dez meses, não apresentou alterações clínicas ou radiológicas sugestivas de infecção por Mycobacterium tuberculosis. Também não se identificou qualquer contato domiciliar com a doença. Para os fins deste estudo, esse paciente foi considerado como tendo um falso resultado positivo. As 177 crianças restantes (96,2%) tiveram resultados negativos.

Onze crianças infectadas com M. tuberculosis foram selecionadas, quatro meninos (37%) e sete meninas (63%). A média de idade foi de 58,5 meses (oito a 132 meses). Seis crianças foram diagnosticadas como portadoras de infecção tuberculosa latente, três tiveram doença pulmonar, uma teve meningite tuberculosa e uma teve pericardite tuberculosa. Duas crianças, dentre as 11, tiveram uma concentração absoluta de IFN-γ após estimulação com antígeno específico <0,35UI/mL, sendo esses dois resultados interpretados como negativos. Uma dessas crianças era um menino de oito meses de idade com doença pulmonar, alternações clínicas e radiológicas persistentes, TST positivo (23mm), mas com baciloscopia e cultura para M. tuberculosis negativas. A outra criança cujo resultado do teste foi negativo era uma menina de 31 meses com doença pulmonar, anormalidades clínicas e radiológicas persistentes e cultura de M. tuberculosis positiva (Tabela 1). Indicou-se tratamento com três drogas para ambas as crianças.

Tabela 1

Características clínicas de crianças consideradas infectadas com Mycobacterium tuberculosis

Excluíram-se as seis crianças com resultados indeterminados para traçar a curva ROC. Tal curva (Figura 1) determinou uma área sob a curva de 0,88 (IC95% 0,82-0,92; p<0,001), de modo que 0,305UI/mL foi estabelecido como o ponte de corte ideal para esta população. Esse novo valor de corte determinado é semelhante ao proposto pelo fabricante (0,350UI/mL), ao contrário de outros estudos que recomendam um ponto de corte muito menor (0,2UI/mL) em pacientes adultos imunocompetentes com tuberculose pulmonar ativa não tratada( ). Para essa concentração absoluta de IFN-γ, a sensibilidade do ensaio encontrada no presente estudo foi de 81,8% (IC95% 48,2-97,2) e a especificidade foi de 98,8% (IC95% 96,0-99,8), atendendo aos requisitos da Organização Mundial da Saúde (OMS) sobre a sensibilidade e a especificidade dos métodos imunológicos (superior a 80 e 95%, respectivamente). O valor preditivo positivo foi de 81,8% (IC95% 46,3-97,4) e o valor preditivo negativo foi de 98,9% (IC95% 96,0-99,8).

Figura 1

Curva Receiver Operating Characteristic para o valor absoluto de interferon-gama após estimulação específica com antígeno.

Discussão

Ensaios de liberação de IFN-γ constituem uma alternativa para o diagnóstico da infecção latente em adultos, uma vez que é um teste mais preciso do que o TST( ). Poucos estudos avaliaram o uso de QTF-G em crianças, mas as características das populações desses estudos são heterogêneas. Em duas recentes meta-análises( , ), os autores verificaram que a acurácia do QTF-G para o diagnóstico da tuberculose em crianças foi boa. Na revisão realizada por Mandalakas( ), crianças coinfectadas pelo HIV ou imunocomprometidas não foram excluídas. Para avaliar a sensibilidade, a tuberculose definitiva (microbiologicamente confirmada) e a provável foram aceitas. Os autores encontraram 17 estudos sobre a sensibilidade do QTF-G, com uma sensibilidade combinada de 83% (IC95% 75-92). Para a avaliação da especificidade do QTF-G, selecionaram- -se seis estudos com uma especificidade combinada de 91% (IC95% 78-100). Sun et al( ) encontraram nove estudos avaliando a sensibilidade de QTF-G para o diagnóstico de tuberculose ativa, resultando em uma sensibilidade combinada de 70% (IC95% 65-75) e, quando casos de tuberculose confirmada apenas por cultura foram considerados, a sensibilidade combinada aumentou para 85%. Eles também encontraram três estudos que avaliaram a especificidade, com uma especificidade combinada de 100% (IC95% 84-100) para QTF-G. Para essa meta-análise, os participantes coinfectados com HIV ou com outras condições de imunocomprometimento, e os que haviam recebido tratamento anti-tuberculose foram excluídos. É igualmente evidente que a prevalência da tuberculose em diferentes contextos pode alterar o desempenho do ensaio, o que justifica a sua avaliação em diferentes populações( , , ). A grande heterogeneidade dos estudos com crianças torna muito difícil a comparação. A população deste estudo tem uma maior proximidade com as condições encontradas na prática diária em nosso país: todas as crianças da presente pesquisa tinham recebido imunização BCG e foram expostas a condições epidemiológicas semelhantes. Nessas condições, este trabalho encontrou valores para a sensibilidade e a especificidade do teste semelhantes aos relatados na meta-análise anteriormente mencionada.

A resposta QTF-G é baseada na liberação de IFN-γ pelos linfócitos T previamente sensibilizados com M. tuberculosis após exposição a duas proteínas presentes na parede celular bacteriana: ESAT-6 e CFP-10. Uma vez que esses antígenos estão ausentes no BCG e na maioria das micobactérias presentes no ambiente, a exposição prévia a essas bactérias e a imunização com BCG não induzem a um resultado positivo do teste( , - ). No presente estudo, todas as 184 crianças do Grupo Controle negativo receberam a vacina BCG, confirmada pela presença da cicatriz. A mediana e a média de idade foram de 35 meses, não muito longe do período recomendado para a vacina BCG, de modo que as crianças estavam potencialmente mais propensas a sofrer interferência no resultado do teste QTF-G devido à vacinação recente. No Grupo Controle, todas as crianças, exceto uma, tiveram resultado negativo no QTF-G, reforçando a constatação de que a imunização com BCG não interfere significativamente nos resultados do QTF-G de segunda geração.

A taxa de resultados indeterminados varia entre os diferentes relatos, aumentando a preocupação com uma possível limitação do uso de QTF-G em crianças. Connell et al(26) encontraram 6% de resultados indeterminados, dos quais 4% se deveram a valores inadequados de controle de mitógeno. Bergamini et al ) testaram 315 crianças com QTF-G e uma taxa maior de resultados indeterminados foi encontrada (21,5%), principalmente em crianças menores de quatro anos. Os autores relataram também que a concentração de resposta do IFN-γ induzida pelo mitógeno tinha aumentado significativamente com a idade. Em outro estudo, Lighter et alencontraram uma taxa muito mais baixa de resultados indeterminados (1,5%) e, embora a quantidade de IFN-γ liberado após a estimulação com o mitógeno estivesse diretamente correlacionada à idade, surpreendentemente, a proporção dos resultados indeterminados foi semelhante em todas as faixas etárias. No presente estudo, houve resultados indeterminados em seis crianças (3,2%), todas com idade inferior a quatro anos. Embora esse percentual pareça não ter afetado o desempenho da QTF-G, nesses casos, é aconselhável repetir o teste em uma segunda amostra, especialmente em crianças pequenas. Devido ao delineamento do presente estudo, a avaliação de uma segunda amostra não era possível.

Por meio de uma curva ROC, o melhor valor de corte para a população estudada foi de 0,305UI/mL, similar ao recomendado pelo fabricante do QTF-G (0,350UI/mL). É importante salientar que, inclusive em uma população pediátrica jovem, o ponto de corte recomendado foi o mesmo daquele recomendado para adultos.

O diagnóstico da tuberculose em crianças é uma tarefa muito difícil e as ferramentas disponíveis ainda estão longe do ideal. No presente estudo, foi apropriado o desempenho do QTF-G para o diagnóstico de infecção por M. tuberculosis em uma população pediátrica jovem. Os principais achados deste estudo foram o alto valor preditivo negativo do teste, parâmetro útil para a exclusão da tuberculose na prática clínica, reduzindo, assim, a prescrição de quimioterapia desnecessária em crianças, e a surpreendentemente baixa percentagem de resultados indeterminados (3,2%). No entanto, com a sensibilidade de 81,8%, apesar de cumprir os critérios da OMS de pelo menos 80%, não se recomenda o QTF-G como o único parâmetro laboratorial para definir a tuberculose em crianças.