Validation and development of an immunonephelometric assay for the determination of alpha-1 antitrypsin levels in dried blood spots from patients with COPD.

OBJECTIVE: To validate and develop an immunonephelometric assay for the determination of alpha-1 antitrypsin (AAT) levels in dried blood spots from COPD patients in Brazil.
METHODS: We determined AAT levels in serum samples and dried blood spots from 192 COPD patients. For the preparation of dried blood spots, a disk (diameter, 6 mm) was placed into a tube, eluted with 200 µL of PBS, and stored overnight at 4ºC. All of the samples were analyzed by immunonephelometry in duplicate. We used the bootstrap resampling method in order to determine a cut-off point for AAT levels in dried blood spots.
RESULTS: The correlation coefficient between the AAT levels in serum samples and those in dried blood spots was r = 0.45. For dried blood spots, the cut-off value was 2.02 mg/dL (97% CI: 1.45-2.64 mg/dL), with a sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of 100%, 95.7%, 27.2%, and 100%, respectively.
CONCLUSIONS: This method for the determination of AAT levels in dried blood spots appears to be a reliable screening tool for patients with AAT deficiency.

Introduction

Alpha-1 antitrypsin (AAT) deficiency is an autosomal codominant genetic disorder resulting from mutations in the SERPINA1 gene, which encodes the synthesis of the AAT protein.( ) It is characterized by a reduction in circulating plasma AAT levels and is associated with an increased risk for early pulmonary emphysema,( ) as well as for liver disease and panniculitis.( )

Once considered a rare disease, AAT deficiency is a highly prevalent genetic condition, according to current epidemiological data, although it is frequently underdiagnosed in clinical practice.( - ) Estimates from studies conducted in eight countries (Canada, the Netherlands, Spain, the United Kingdom, Sweden, New Zealand, and Australia) show that only 0.41% and 0.35% of individuals with the PiZZ phenotype and the SS phenotype, respectively, had been identified.( ) In Brazil, there are no epidemiological data on the prevalence of AAT deficiency or the frequency of deficiency alleles.( )

Recent recommendations from the World Health Organization, the American Thoracic Society, and the European Respiratory Society advocate the use of assays for the quantitative determination of plasma AAT concentrations, especially in patients with COPD, liver disease of unknown etiology, necrotizing panniculitis, bronchiectasis of unknown etiology, or a family history of liver disease, necrotizing panniculitis, COPD, and bronchiectasis.( , ) Early diagnosis is essential to the prognosis of individuals with AAT deficiency, given that the natural history of pulmonary involvement is directly affected by potentially modifiable environmental factors, such as smoking.( , )

The diagnosis of AAT deficiency is based on the quantitative determination of serum AAT levels, as well as on phenotyping, genotyping, or both.( , ) One of the problems for conducting screening programs is that of blood handling and transportation. The implementation of a dried blood spot method would make it possible to use it in population programs, because it is a minimally invasive method, sample storage is easy, and it allows sample transportation from different regions to the central laboratory, with no need for complex and costly methods of sample preservation.( , ) In addition, these samples can also be used for phenotyping and genotyping, if necessary.( , ) In Brazil, no dried blood spot method for the determination of AAT levels has been developed, and few laboratories can determine serum AAT levels. Considering the landmass of Brazil, it is important that a dried blood spot method be implemented in the country.

Therefore, the objective of the present study was to develop and validate an immunonephelometric assay for the determination of AAT levels in dried blood spots from COPD patients in Brazil.

Methods

This was a cross-sectional study evaluating COPD patients recruited from the COPD Outpatient Clinic of the Federal University of São Paulo Pulmonary Rehabilitation Center between July and September of 2011.

The inclusion criteria were as follows: having been diagnosed with COPD in accordance with the criteria established by the European Respiratory Society-i.e., having an FEV1/FVC less than 88% predicted (males) or less than 89% predicted (females) after bronchodilator use( ); having been clinically stable in the last six weeks( ); and being 40 years of age or older. Patients with a previous diagnosis of AAT deficiency were excluded from the study, as were those with clinical symptoms of asthma and those with any non-pulmonary inflammatory or infectious process leading to increased serum AAT concentrations.

All patients gave written informed consent. The determination of AAT levels was performed at the Centro de Diagnóstico Brasil (Brazil Diagnostic Center), located in the city of São Paulo. The present study was approved by the Research Ethics Committee of the Federal University of São Paulo Hospital São Paulo (Protocol no. 0633/10).

All study participants had recently undergone spirometry (less than one year previously) with a portable spirometer (Easy One(r); NDD Medical Technologies, Chelmsford, MA, USA, and Zurich, Switzerland). The reference values used to calculate percentage of predicted values were based on the reference standards of the Third National Health and Nutrition Examination Survey.( )

After analysis of the spirometry results and application of the inclusion and exclusion criteria, the patients underwent blood sample collection using two METHODS: blood was drawn from the cubital vein into a tube containing EDTA and centrifuged at 3,200 rpm for 30 min, with the serum being separated and stored at −20ºC; and a drop of peripheral blood, obtained by pricking the distal region of one of the fingers, was placed on a filter paper card (Whatman 903, lot W101; Whatman/GE Healthcare, Florham Park, NJ, USA); the filter paper card was dried in room air for 12 h and then stored at −20ºC until the time of analysis.( )

For the analysis of dried blood spots, the filter paper cards were cut into disks (diameter, 6 mm) and the disks were placed into Eppendorf tubes, to which 200 µL of PBS were added. This solution remained at 4ºC for 12 h overnight. On the following day, the disks were removed from the solution and, subsequently, the samples were centrifuged at 3,200 rpm for 30 min in order to separate the disk residues (solid part) from the liquid part of the samples, which is called eluate. The serum was thawed and centrifuged at 3,200 rpm for 30 min. Serum and eluate samples were analyzed on a Siemens BNII system (Siemens Healthcare, Indianapolis, IN, USA).

The system was calibrated with the N Protein Standard SL (Nephelometry; Siemens Healthcare). The calibration curves were tested at different dilutions (1:160; 1:80; 1:40; 1:20; 1:10; and 1:5). The margin of deviation from the standard protein and the value obtained were accepted within a range of +5 to −5. In addition, daily checks with the standard SL were carried out at different AAT concentrations: low (101.0 mg/dL); medium (159.0 mg/dL); and high (231.0 mg/dL).

The analysis of AAT concentrations was performed using the N-antiserum, which is a liquid animal serum produced by immunization of rabbits with highly purified human AAT (Siemens Healthcare).

Eluate and serum samples were placed into 5-mL acrylic tubes and analyzed by immunonephelometry. This method is characterized by the emission of an intense beam of light over a sample containing immune complexes between the AAT protein and anti-AAT antibodies. The beam of light, upon contact with this immune complex, is reflected and collected by a photometer, the intensity of the reflected radiation being proportional to the amount of antigen-antibody present in the sample. Serum samples are automatically diluted by the system at a ratio of 1:20, which is the concentration required to achieve antigen-antibody equilibrium. However, dried blood spots contain much lower serum levels, making dilution unnecessary (1:1), as reported in previous studies.( , )

The statistical analysis was performed with the Statistical Package for the Social Sciences, version 18.0 for Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, USA). Continuous variables are expressed as mean and standard deviation, and categorical variables are expressed as percentage. Pearson's correlation coefficient was used to investigate the association between two parametric variables, namely, serum AAT values obtained in duplicate, AAT values in eluates, measured in duplicate; and serum AAT values relative to AAT values in eluates.

We used the bootstrap resampling method in order to determine a cut-off point and a confidence interval of 97% for dried blood spots. This method consists of a resampling technique, through which data from the actual sample (the study sample) are randomly selected (with N - 1) for observation and confidence intervals are generated for each calculated value. The sample is randomly selected 1,000 times, and 1,000 models are made for each of these N - 1 samples, increasing the power of the sample in cases of small samples and improving the estimators of confidence when the sample distribution is unknown or when the population distribution is unknown. The cut-off point for dried blood spots was also characterized in terms of sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV).

Results

A total of 240 patients were contacted over the three-month study period. However, only 192 patients met the eligibility criteria. Of the 48 individuals who were excluded, 17 had exacerbations, 18 did not meet the spirometry criteria for COPD, 5 showed a bronchodilator response and had a history consistent with asthma, 3 had bronchiectasis, 2 had pulmonary sarcoidosis, 2 had lung cancer, and 1 had sequelae of pulmonary tuberculosis.

The demographic data of the study participants are described in Table 1. There were no significant gender-related differences. The mean age of the study population was 68.5 ± 9.6 years. The individuals were predominantly White.

Table 1

Demographic characteristics of the sample (N = 192).a

The spirometry results are described in Table 1, and, as expected for COPD patients, the values for percentage of predicted FEV1/FVC and percentage of predicted FEV1 characterized obstructive lung disease.

To test sample reproducibility, AAT levels in serum and in eluates from dried blood spots were determined in duplicate. Figure 1 shows the correlation between the duplicate measurements of serum AAT levels (r = 0.98), and Figure 2A shows the correlation between the duplicate measurements of AAT levels in eluates from dried blood spots (r = 0.52).

Figure 1

Correlation between the duplicate measurements of serum alpha-1 antitrypsin (AAT) levels (N = 192).

Figure 2

In A, correlation between the duplicate measurements of alpha-1 antitrypsin (AAT) levels in eluates from dried blood spots (N = 192). In B, correlation between the duplicate measurements of AAT levels in eluates from dried blood spot samples that were not turbid (n = 116).

Some eluate samples were turbid in one of the duplicate measurements performed, affecting the AAT value obtained and causing disparity between the duplicate measurements of the same sample. Therefore, we performed a second correlation analysis of the duplicate measurement results of eluates from dried blood spot samples that were not turbid (n = 116). The second analysis showed a correlation of r = 0.84 (Figure 2B). However, none of the three patients with AAT deficiency, as determined by the measurement of serum AAT levels, a method considered to be the gold standard, were included in this analysis, because one of the duplicate samples was turbid.

For the analysis of correlation between the serum AAT levels and the AAT levels in eluates from dried blood spots, we selected one of the serum AAT values and one of the AAT values in eluate samples that were not turbid. The observed correlation was r = 0.45 (Figure 3).

Figure 3

Correlation between the measurements of serum alpha-1 antitrypsin (AAT) levels and the measurements of AAT levels in eluates from dried blood spots (n = 192).

To determine the sensitivity and specificity of the eluate method, we used the bootstrap resampling method, comparing the AAT values measured in serum (gold standard) with those measured in eluates from dried blood spots, so as to determine a cut-off point for AAT values in eluates; the value obtained was 2.02 mg/dL (97% CI: 1.45-2.64). The values for sensitivity, specificity, PPV, and NPV of the AAT values in eluates from dried blood spots are shown in Table 2. All three patients with AAT deficiency in our sample had AAT levels below 1.80 mg/dL (62.6 mg/dL in serum); the two values (2.02 mg/dL and 2.64 mg/dL) had a sensitivity and NPV of 100%. With the cut-off point of 2.02 mg/dL, 14 of the 192 patients in our sample would have to undergo determination of serum AAT levels for establishing the diagnosis of AAT deficiency in 3 patients. However, with the value of 2.64 mg/dL, 32 patients would have to undergo determination of serum AAT levels for establishing this diagnosis also in 3 patients.

Table 2

Sensitivity, specificity, positive predictive value, and negative predictive value of cut-off points calculated by using the bootstrap resampling technique.a

Discussion

The objective of the present study was to develop and validate an immunonephelometric assay for the determination of AAT levels in eluates from dried blood spots in patients with COPD. We chose to create a confidence interval starting at the cut-off point determined by the bootstrap resampling method, evaluating the sensitivity and specificity of the values and their effect on clinical choices for screening new patients.

The quantitative determination of serum AAT levels is recommended for the diagnosis of AAT deficiency.( ) However, this test in not performed in most Brazilian cities; handling, storage, transportation, and costs make its large-scale use unfeasible. Therefore, analysis of dried blood spots by immunonephelometry becomes an attractive option in terms of accessibility,( ) given that the samples can be mailed to a central laboratory from anywhere in Brazil.( ) In the present study, the dried blood spot samples were frozen at −20ºC, because they were not analyzed immediately after collection. However, dried blood spot samples can be maintained in room air for one week, as well as in temperatures of 4ºC and −20ºC for four weeks.( )

The results of duplicate measurements of serum AAT levels were highly reproducible (r = 0.98), which shows excellent sample stability. The correlation between the serum AAT levels and the AAT levels in dried blood spots was low (r = 0.45), suggesting that the AAT values measured in dried blood spots cannot be quantitatively compared with those measured in serum. This finding differs from those reported by some authors, who observed a good correlation between the determination of AAT levels in dried blood spots and the determination of serum AAT levels. Wencker et al. validated an immunonephelometric assay in 427 patients with lung disease and found an excellent correlation between the values measured in dried blood spots and those measured in serum (r = 0.95), with no false-negative or false-positive results.( ) The findings corroborate those of Costa et al., who obtained a good correlation between 500 serum and dried blood spot samples (r2 = 0.86).( ) However, those authors emphasize that, although the two techniques have a good correlation, the dried blood spot method is a semi-quantitative rather than a quantitative method, being appropriate for screening, on the basis of a cut-off point, providing positive or negative results for the presence of the AAT protein. One group of Italian researchers also validated a dried blood spot method in comparison with the standard serum method in 149 patients who had low or very low serum AAT levels (0.16-0.53 g/L) and in individuals who had intermediate or normal AAT levels (0.54-2.93 g/L). The correlation coefficients of the two groups were r2 = 0.98 and r2 = 0.90, respectively.( ) However, those authors did not analyze their results in terms of PPV or NPV for the evaluation of sensitivity and specificity.

The fact that there is recognized variation in immunonephelometric assays led us to calculate a confidence interval, obtaining the minimum and maximum values in relation to the cut-off point. To determine this interval, we used the bootstrap resampling method, because the population of individuals with AAT deficiency was small. This analysis made it possible to increase the sample power, because the calculation was repeated 1,000 times, establishing a cut-off point of 2.02 mg/dL and making the 97% confidence interval more accurate (1.45-2.64 mg/dL). On the basis of these results, we evaluated the sensitivity, specificity, PPV, and NPV of the cut-off point established through this type of sampling (Table 2). For the cut-off point of 2.02 mg/dL obtained for dried blood spots, we found a sensitivity and specificity of 100% and 95.7%, respectively, with a PPV and NPV of 27.2% and 100%, respectively. By using the maximum value in the confidence interval, it is possible that no patient with AAT deficiency will be identified as normal. After a detailed review of the literature, we found no studies reporting confidence interval values for AAT levels in dried blood spots.

To Kwon & Farrell, screening tests should be highly sensitive, because this characteristic reduces the probability of an individual having a false-negative result. False-negative results are the major concern in screening tests, because individuals will probably be identified only when they start having symptoms, which sometimes occurs late in the disease, compromising prognosis.( ) Conversely, the establishment of a higher cut-off point so that all cases with deficiency can be detected will result in a larger number of false-positive results. The disadvantage of false-positive results in the detection of AAT deficiency is evident, because a larger number of serum tests will be conducted.( ) However, it must be borne in mind that the process of screening new patients for AAT deficiency should begin with screening tests rather than end with them.

Regarding the cut-off point for dried blood spots for screening patients for AAT deficiency, we found two studies in the literature that have reported different values. One study, which evaluated 300 patients with COPD and 200 healthy individuals, observed that all patients with AAT deficiency had values below 1.8 mg/dL in dried blood spots, which was equivalent to a serum concentration of 100 mg/dL.( ) After that study, two groups of authors adopted the same cut-off point as that suggested by Costa et al.( ) and found that dry blood spot tests produced no false-positive or false-negative results when compared with genetic tests, showing that the value established in that study was highly accurate.( , ) In 2006, Gorrini et al. evaluated 114 patients and established a cut-off point of 1.13 g/L for dried blood spots, with a sensitivity and specificity of 0.92 and 0.90, respectively.( ) These values are similar to those reported in the present study; however, the cut-off point stipulated in the present study was considerably higher, because we decided to adopt a sensitivity of 100%, greatly reducing the possibility of false-negative results.

The immunonephelometric assay for the determination of AAT levels in dried blood spots that was developed in the present study showed a moderate correlation (r = 0.54) between the duplicate measurements of the same sample. However, some samples were turbid in one of the duplicate measurements, a factor that reduces light reflection at the time of analysis and consequently reduces AAT levels, which could have directly affected the correlation of the duplicate dried blood spots. A sub-analysis only of the duplicate measurements of samples that were not turbid revealed a good correlation (r = 0.84). This sub-analysis did not include any patients with AAT deficiency, which means that this finding may not be representative for the population of individuals with AAT deficiency. There are no published studies in the literature that have addressed the reproducibility between serum samples and dried blood spots or the effect of sample turbidity, but this finding suggests that samples that are turbid should be interpreted with caution.

We conclude that the use of dried blood spots is an excellent option for screening patients for AAT deficiency, because this method had high sensitivity and specificity, as well as a low PPV and NPV. However, the values obtained by this method cannot be quantitatively compared with serum AAT values. We believe that it is mandatory to choose the maximum value in the confidence interval in order to minimize false-negative diagnoses. Therefore, the dried blood spot method is an attractive solution to the current state of underdiagnosis of AAT deficiency in Brazil, because it enables rapid, efficient, and minimally invasive screening in the diagnosis of this deficiency at a low cost. Further studies investigating the prevalence of AAT deficiency are needed in order to implement specific programs for the treatment and management of this condition.

Introdução

A deficiência de alfa-1 antitripsina (AAT) é uma alteração genética autossômica codominante, resultante de mutações no gene SERPINA1 responsável pela síntese da proteína AAT.( ) É caracterizada por redução dos níveis plasmáticos da AAT circulante e está associada ao aumento do risco de enfisema pulmonar precoce,( ) doenças hepáticas e paniculite.( )

A deficiência de AAT já foi considerada uma doença rara; entretanto, segundo dados epidemiológicos atuais, é uma condição genética altamente prevalente, mas frequentemente subdiagnosticada na prática clínica.( - ) Estimativas de estudos desenvolvidos em oito países (Canadá, Holanda, Espanha, Reino Unido, Itália, Suécia, Nova Zelândia e Austrália) mostram que apenas 0,41% e 0,35% dos indivíduos com fenótipo PiZZ e SS, respectivamente, já tinham sido reconhecidos.( ) No Brasil, não existem dados epidemiológicos referentes à prevalência da deficiência de AAT, nem da frequência dos alelos deficientes.( )

Recentes recomendações da Organização Mundial de Saúde, American Thoracic Society e European Respiratory Society preconizam a realização de testes quantitativos para a concentração plasmática de AAT, especialmente em pacientes com DPOC, doença hepática com etiologia desconhecida, paniculite necrosante, bronquiectasia com etiologia desconhecida ou história familiar de doença hepática, paniculite necrosante, DPOC e bronquiectasia.( , ) O diagnóstico precoce é fundamental para o prognóstico de pessoas com deficiência de AAT, uma vez que a história natural do comprometimento pulmonar é diretamente afetada por fatores ambientais potencialmente modificáveis, como o tabagismo.( , )

O diagnóstico da deficiência de AAT é baseado na avaliação quantitativa dos níveis séricos de AAT e na determinação do fenótipo através da fenotipagem e/ou genotipagem.( , ) Um dos problemas para a realização de programas de triagem refere-se ao manuseio e transporte do sangue. A implantação da técnica de sangue em papel-filtro possibilitaria a sua utilização em programas populacionais, pois é uma técnica minimamente invasiva, de fácil armazenamento e que permite o seu transporte de diferentes regiões para o laboratório central, sem necessidade de técnicas complexas e de alto custo para a conservação das amostras.( , ) Além disso, essas amostras também podem ser utilizadas para a realização de fenotipagem e genotipagem, se necessário.( , ) A técnica de sangue em papel-filtro para a dosagem da AAT ainda não foi desenvolvida no Brasil, e são poucos os laboratórios que dosam a sua concentração sérica. Considerando-se a extensão territorial do Brasil, é importante a implantação do método de sangue em papel-filtro no país.

Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo o desenvolvimento e a validação de um método de dosagem de AAT por imunonefelometria em amostras de sangue em papel-filtro em pacientes com DPOC no Brasil.

Métodos

Este foi um estudo transversal que avaliou pacientes com DPOC recrutados no Ambulatório de DPOC do Centro de Reabilitação Pulmonar da Universidade Federal de São Paulo no período entre julho e setembro de 2011.

Os critérios de inclusão foram os seguintes: ter diagnóstico de DPOC segundo os critérios da European Respiratory Society: apresentar VEF1/CVF em % do previsto após o uso de broncodilatador menor do que 88% para homens e menor do que 89% para mulheres( ); apresentar estabilidade clínica nas ultimas seis semanas( ); e ter idade igual ou superior a 40 anos. Foram excluídos do estudo pacientes com diagnóstico prévio de deficiência de AAT com sintomas clínicos de asma ou qualquer quadro inflamatório ou infeccioso não pulmonar que elevasse a concentração sérica de AAT.

Todos os pacientes assinaram um termo de consentimento livre esclarecido. As dosagens de AAT foram realizadas pelo Centro de Diagnóstico Brasil, localizado na cidade de São Paulo. A presente pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa do Hospital São Paulo/Universidade Federal de São Paulo, protocolo número 0633/10.

Todos os pacientes incluídos no estudo tinham realizado espirometria recentemente (há menos de um ano) utilizando um espirômetro portátil, da marca Easy One(r) (NDD Medical Technologies, Chelmsford, MA, EUA, e Zurique, Suíça). Os valores de referência para o cálculo do percentual do previsto basearam-se nos padrões de referência do terceiro National Health and Nutrition Examination Survey.( )

Após a avaliação da espirometria e dos critérios de inclusão e exclusão, os pacientes foram submetidos à coleta de sangue de duas formas: sangue colhido da veia cubital em um tubo com EDTA e centrifugado a 3.200 rpm durante 30 min, sendo o soro separado e armazenado à −20ºC; e gotejamento do sangue periférico, obtido por uma picadura na região distal de um dos dedos da mão, sobre um papel-filtro (Whatman 903, lot W101; Whatman/GE Healthcare, Florham Park, NJ, EUA); o papel-filtro foi seco durante 12 h em ar ambiente e então armazenado à −20ºC até o momento da análise.( )

Para a análise das amostras de sangue em papel-filtro, os cartões foram perfurados com um diâmetro de 6 mm, e o círculo foi colocado em tubos Eppendorf com a adição de 200 µL de PBS. Essa solução permaneceu a 4ºC por 12 h durante a noite que antecedeu a sua análise. No dia posterior, os papeis foram retirados da solução e, subsequentemente, a amostra foi centrifugada com rotação de 3.200 rpm durante 30 min para a separação dos resíduos do papel-filtro (parte sólida) do líquido da amostra, que é denominado eluato. Quanto ao soro, ele foi descongelado e centrifugado durante 30 min com rotação de 3.200 rpm. Tanto as amostras do soro quanto as do eluato foram analisadas em um equipamento Siemens BNII (Siemens Healthcare, Indianápolis, IN, EUA).

A calibração do equipamento foi realizada com o soro calibrador padrão SL de proteína N (Nephelometry; Siemens Healthcare). As curvas de calibração foram testadas com diferentes diluições (1:160; 1:80; 1:40; 1:20; 1:10; e 1:5). A margem de desvio da proteína padrão e o valor obtido foram aceitos entre uma variação de +5 a −5. Além disso, foram realizados controles diários com o padrão SL em diferentes concentrações de AAT: baixa (101,0 mg/dL); média (159,0 mg/dL); e alta (231,0 mg/dL).

Para a análise da concentração de AAT, foi utilizado o reagente antissoro N, que é um soro animal líquido produzido por imunização de coelhos com AAT humana altamente purificada (Siemens Healthcare).

As amostras do eluato e as amostras séricas foram colocadas em tubos de acrílico de 5 mL para serem analisadas pelo método de imunonefelometria. Esse método caracteriza-se pela emissão de um feixe de luz intenso sobre uma amostra que contém complexos imunes entre a proteína de AAT e anticorpos anti-AAT. O feixe de luz, ao entrar em contato com esse complexo imune, é refletido e captado por um fotômetro, sendo a intensidade da radiação refletida proporcional à quantidade de antígeno-anticorpo presente na amostra. Para as amostras séricas, o equipamento dilui automaticamente as amostras em 1:20, que é a concentração necessária para atingir o equilíbrio antígeno-anticorpo no ensaio. No entanto, as amostras de sangue em papel-filtro contêm um volume muito menor de soro, tornando a diluição desnecessária (1:1), conforme publicações anteriores.( , )

A análise estatística foi realizada no programa Statistical Package for the Social Sciences, versão 18.0 para Windows (SPSS Inc, Chicago, IL, EUA). As variáveis contínuas foram expressas como média e desvio-padrão, e as variáveis categóricas foram expressas como porcentagem. A correlação de Pearson foi aplicada para determinar a associação entre duas variáveis paramétricas, a saber, valores séricos de AAT obtidos em duplicata; valores do eluato medidos em duplicata; e valores de AAT sérica em relação aos valores do eluato.

Para a determinação do ponto de corte e do intervalo de confiança de 97% para as amostras de sangue em papel-filtro, foi utilizado o método de reamostragem bootstrap. Esse método consiste na técnica de reamostragem, pela qual os dados da amostra real (a amostra do estudo) são sorteados (com N − 1) para observações, sendo gerados intervalos de confiança para cada valor calculado. A amostra é sorteada 1.000 vezes, e são realizados 1.000 modelos para cada uma dessas amostras N − 1, aumentando o seu poder em casos de amostras pequenas e melhorando os estimadores de confiança quando a distribuição da amostra não é conhecida ou quando a distribuição populacional não é conhecida. O ponto de corte para as amostras de sangue em papel-filtro foi também caracterizado pela sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN).

Resultados

Foram contatados 240 pacientes ao longo dos três meses do estudo. No entanto, somente 192 pacientes preenchiam os critérios de elegibilidade. Dos 48 indivíduos excluídos, 17 apresentavam exacerbações, 18 não preencheram os critérios espirométricos de DPOC, 5 apresentavam resposta ao broncodilatador e história compatível com asma, 3 apresentavam bronquiectasia, 2 apresentavam sarcoidose pulmonar, 2 apresentaram câncer pulmonar e 1 apresentava sequela de tuberculose pulmonar.

Os dados demográficos dos participantes do estudo estão descritos na Tabela 1. Não houve diferenças significativas entre os sexos. A média de idade da população estudada foi de 68,5 ± 9,6 anos. Os indivíduos eram, predominantemente, da raça branca.

Tabela 1

Características demográficas da amostra (N = 192).a

As medidas da espirometria estão descritas na Tabela 1, e, como esperado para pacientes com DPOC, os valores da relação VEF1/CVF e de VEF1, em percentual do valor previsto, caracterizavam o distúrbio ventilatório obstrutivo.

A quantificação de AAT no soro e no eluato de sangue em papel-filtro foi realizada em duplicata para a avaliação da reprodutibilidade da amostra. A Figura 1 mostra a correlação entre as duas medidas da AAT sérica (r = 0,98), e a Figura 2A mostra a correlação entre as duas medidas do eluato de sangue em papel-filtro (r = 0,52).

Figura 1

Correlação entre as duas medidas de alfa-1 antitripsina (AAT) sérica (N = 192).

Figura 2

Em A, correlação entre as duas medidas de alfa-1 antitripsina (AAT) no eluato de sangue em papel-filtro (N = 192). Em B, correlação entre as duas medidas de AAT no eluato de sangue em papel-filtro em amostras sem turbidez (n = 116).

Algumas amostras de eluato apresentaram turbidez em uma das duas medidas realizadas, interferindo no valor obtido de AAT e ocasionando disparidade entre as duas medidas da mesma amostra. Por esse motivo, realizamos uma segunda correlação entre as amostras que não apresentaram turbidez nas duas medidas do eluato (n = 116). A segunda análise apresentou uma correlação de r = 0,84 (Figura 2B). Entretanto, nenhum dos três pacientes com deficiência de AAT, conforme as medidas de AAT sérica, método considerado como o padrão ouro, foi incluído nessa análise, pois havia turbidez em uma das amostras da duplicata.

Para a análise da correlação entre a concentração de AAT sérica e a do eluato de sangue em papel-filtro, foi selecionado um dos valores dessa no soro e no eluato que não apresentasse turbidez. A correlação encontrada foi de r = 0,45 (Figura 3).

Figura 3

Correlação entre as medidas de alfa-1 antitripsina (AAT) sérica e as medidas do eluato de sangue em papel-filtro (N = 192).

Para a determinação da sensibilidade e especificidade do método utilizando o eluato, foi utilizado o método de reamostragem bootstrap, comparando os valores de medição do soro (padrão ouro) com os valores encontrados no eluato de sangue em papel-filtro para a determinação de um ponto de corte para os valores obtidos no eluato; o valor encontrado foi de 2,02 mg/dL (IC97%: 1,45-2,64). Os valores de sensibilidade, especificidade, VPP e VPN dos valores de eluato de sangue em papel-filtro estão demonstrados na Tabela 2. Todos os três pacientes com deficiência de AAT da amostra apresentavam dosagens de AAT inferiores a 1,80 mg/dL (62,6 mg/dL no soro); os dois valores (2,02 mg/dL e 2,64 mg/dL) apresentaram sensibilidade e VPN de 100%. Quando utilizamos o ponto de corte de 2,02 mg/dL, do total de 192 pacientes da amostra, 14 precisariam realizar o exame no soro para o diagnóstico dos 3 pacientes com deficiência de AAT. Entretanto, com o valor de 2,64 mg/dL, 32 pacientes precisariam realizar o exame no soro para o diagnóstico dos mesmos 3 pacientes.

Tabela 2

Sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivos e negativos em relação a pontos de corte pelo coeficiente de correlação bootstrap.a

Discussão

O objetivo do presente estudo foi desenvolver e validar a técnica de dosagem da proteína AAT em eluato de sangue em papel-filtro pelo método de imunonefelometria em pacientes com DPOC. Optamos por criar um intervalo de confiança a partir do ponto de corte definido pela técnica de reamostragem bootstrap, avaliando a sensibilidade e a especificidade dos valores e a sua interferência na escolha clínica para a triagem de novos pacientes.

O teste quantitativo da AAT sérica é recomendado para o diagnóstico da deficiência de AAT.( ) Entretanto, esse teste não é realizado na grande maioria das cidades brasileiras; o manuseio, armazenamento, transporte e custos inviabilizam a sua utilização em larga escala. Em vista disso, a imunonefelometria de amostras de sangue em papel-filtro se torna uma atraente opção para a acessibilidade do teste,( ) já que o mesmo pode ser enviado pelo correio de qualquer lugar do Brasil para um laboratório central.( ) No presente estudo, as amostras de sangue em papel-filtro foram congeladas a −20ºC, pois elas não foram analisadas logo após a sua coleta. Porém, as amostras de sangue em papel-filtro podem ser mantidas em ar ambiente durante o período de uma semana, assim como nas temperaturas de 4ºC e −20ºC durante quatro semanas.( )

Os resultados de AAT das amostras séricas em duplicata foram altamente reprodutíveis (r = 0,98), mostrando a excelente estabilidade das amostras. A correlação entre a AAT sérica e a determinada a partir de amostras de sangue em papel-filtro foi baixa (r = 0,45), sugerindo que os valores em amostras de sangue em papel-filtro não podem ser comparados quantitativamente aos encontrados no soro. Esse achado difere dos encontrados por alguns autores, que observaram uma boa correlação entre a determinação em amostra de sangue em papel-filtro e a dosagem sérica de AAT. Wencker et al. realizaram a validação do método de imunonefelometria em 427 pacientes com doença pulmonar e encontraram uma correlação excelente dos valores obtidos em sangue em papel-filtro e os em soro (r = 0,95), sem nenhum resultado falso-negativo ou falso-positivo.( ) Esses resultados corroboram os achados de Costa et al. em 500 amostras séricas e em sangue em papel-filtro, que obtiveram uma boa correlação (r2 = 0,86).( ) Entretanto, os autores salientam que, apesar de as duas técnicas apresentarem boa correlação, o uso de sangue em papel-filtro não é um método quantitativo, mas semiquantitativo, sendo apropriado para a triagem, baseado em um ponto de corte, fornecendo resultados positivos ou negativos para a presença da proteína de AAT. Um grupo de pesquisadores italianos também validou o método com o uso de sangue em papel-filtro comparado com o método padrão no soro em 149 pacientes com concentrações séricas baixas ou muito baixas de AAT (0,16-0,53 g/L) e em indivíduos com AAT em níveis intermediários ou normais (0,54-2,93 g/L). Os coeficientes de correlação dos dois grupos foram r2 = 0,98 e r2 = 0,90, respectivamente.( ) No entanto, os autores não avaliaram seus resultados em relação a VPP e VPN para a avaliação de sensibilidade e especificidade.

O fato de haver uma reconhecida variação no método de imunonefelometria nos levou a calcular um intervalo de confiança, obtendo-se os valores mínimos e máximos em relação ao valor do ponto de corte. Para a elaboração desse intervalo, foi utilizado o método de reamostragem bootstrap, pois a população de indivíduos portadores da deficiência foi pequena. Essa análise possibilitou o aumento do poder amostral, pois ela refez o cálculo 1.000 vezes, encontrando o ponto de corte de 2,02 mg/dL e deixando o IC97% mais preciso (1,45-2,64 mg/dL). A partir desses resultados, foram avaliadas a sensibilidade, especificidade, VPP e VPN do ponto de corte estabelecido por esse tipo de amostragem (Tabela 2). Para o ponto de corte de 2,02 mg/dL obtido a partir de amostras de sangue em papel-filtro, encontramos uma sensibilidade e uma especificidade de 100% e 95,7%, respectivamente, com VPP e VPN de 27,2% e 100%, respectivamente. Com a utilização do valor máximo do intervalo de confiança, é possível que nenhum paciente com deficiência de AAT seja identificado como normal. Após uma detalhada revisão da literatura, não foi encontrado nenhum estudo que apresentasse valores de intervalo de confiança para os valores de AAT a partir de amostras de sangue em papel-filtro.

Para Kwon e Farrell, os testes de rastreamento devem ser altamente sensíveis, pois essa característica diminui a probabilidade de um indivíduo ter um resultado falso-negativo. A maior preocupação em testes de rastreamento são os resultados falso-negativos, pois, provavelmente, o indivíduo será identificado somente quando apresentar algum sintoma, às vezes já muito tardiamente, comprometendo o seu prognóstico.( ) Por outro lado, visando à detecção de todos os casos com a deficiência, estabelecendo-se um ponto de corte mais elevado, ocorrerá um maior número de casos falso-positivos. A desvantagem dos resultados falso-positivos na detecção de deficiência de AAT é evidente, pois mais exames séricos serão realizados.( ) Entretanto, é importante relembrar que o rastreamento para novos pacientes com deficiência de AAT deve começar pela realização de testes de triagem, e não terminar com eles.

Em relação ao ponto de corte dos valores obtidos a partir das amostras de sangue em papel-filtro para a triagem de pacientes com deficiência de AAT, encontramos na literatura dois estudos com valores distintos. Um estudo avaliou 300 pacientes com DPOC e 200 indivíduos saudáveis, e foi observado que todos os pacientes com deficiência de AAT tinham valores abaixo de 1,8 mg/dL em amostras de sangue em papel-filtro, que era equivalente a 100 mg/dL na concentração sérica.( ) Após aquele estudo, dois grupos de autores adotaram o mesmo ponto de corte sugerido por Costa et al.,( ) não encontrando resultados falso-positivos ou falso-negativos quando comparados a testes genéticos, mostrando que o valor estabelecido naquele estudo era altamente preciso.( , ) Em 2006, Gorrini et al. avaliaram 114 pacientes e estabeleceram um ponto de corte de 1,13 g/L para amostras de sangue em papel-filtro, com sensibilidade e especificidade de 0,92 e 0,90, respectivamente.( ) Esses valores foram semelhantes aos demonstrados no presente estudo; entretanto, o ponto de corte estipulado na presente pesquisa foi consideravelmente maior, pois decidimos adotar uma sensibilidade de 100%, diminuindo muito a possibilidade de resultados falso-negativos.

A imunonefelometria em sangue em papel-filtro desenvolvida no presente estudo apresentou uma correlação moderada (r = 0,54) entre os dois valores da mesma amostra. Entretanto, algumas amostras apresentaram turbidez em um dos valores da duplicata, fator que reduz a reflexão da luz no momento da análise e, consequentemente, reduz os valores de AAT, o que pode ter interferido diretamente na correlação da duplicata em sangue em papel-filtro. Uma subanálise com somente as amostras que apresentaram os dois valores da duplicata no eluato sem turbidez apresentou uma boa correlação (r = 0,84). Nessa subanálise, nenhum paciente com deficiência de AAT foi incluído, o que faz com que esse achado possa não ser representativo para a população de indivíduos com deficiência de AAT. Nenhum estudo publicado na literatura comenta sobre a reprodutibilidade entre as amostras de soro e de sangue em papel-filtro, tampouco sobre a interferência da turbidez nas amostras, mas esse achado sugere que as amostras que apresentarem turbidez devem ser interpretadas com cautela.

Concluímos que a utilização de amostras de sangue em papel-filtro é uma excelente alternativa para a triagem de pacientes com deficiência de AAT, pois esse método mostrou alta sensibilidade e especificidade, com baixo VPP e VPN. Entretanto, o método não pode ser comparado quantitativamente aos valores séricos de AAT. Cremos ser obrigatória a escolha do valor superior do intervalo de confiança para minimizar os diagnósticos falso-negativos.Em vista disso, o método com o uso de sangue em papel-filtro é uma atraente solução para a atual situação de subdiagnóstico da deficiência de AAT no Brasil, pois permite uma triagem rápida, eficaz, pouco invasiva e de baixo custo no diagnóstico dessa deficiência. Novos estudos que investiguem a prevalência da deficiência de AAT são necessários para a implantação de programas específicos de tratamento e manejo dessa condição.