Effect of tramadol on lung injury induced by skeletal muscle ischemia-reperfusion: an experimental study.

OBJECTIVE: To determine whether tramadol has a protective effect against lung injury induced by skeletal muscle ischemia-reperfusion.
METHODS: Twenty Wistar male rats were allocated to one of two groups: ischemia-reperfusion (IR) and ischemia-reperfusion + tramadol (IR+T). The animals were anesthetized with intramuscular injections of ketamine and xylazine (50 mg/kg and 10 mg/kg, respectively). All of the animals underwent 2-h ischemia by occlusion of the femoral artery and 24-h reperfusion. Prior to the occlusion of the femoral artery, 250 IU heparin were administered via the jugular vein in order to prevent clotting. The rats in the IR+T group were treated with tramadol (20 mg/kg i.v.) immediately before reperfusion. After the reperfusion period, the animals were euthanized with pentobarbital (300 mg/kg i.p.), the lungs were carefully removed, and specimens were properly prepared for histopathological and biochemical studies.
RESULTS: Myeloperoxidase activity and nitric oxide levels were significantly higher in the IR group than in the IR+T group (p = 0.001 for both). Histological abnormalities, such as intra-alveolar edema, intra-alveolar hemorrhage, and neutrophil infiltration, were significantly more common in the IR group than in the IR+T group.
CONCLUSIONS: On the basis of our histological and biochemical findings, we conclude that tramadol prevents lung tissue injury after skeletal muscle ischemia-reperfusion.

Introduction

Ischemia-reperfusion injury is one of the most common types of cell injury that occurs in a variety of surgical practices. Reperfusion of ischemic organs can result in tissue injury, which manifests as microvascular and parenchymal cell dysfunction. The mechanisms underlying ischemia-reperfusion injury have been previously described; polymorphonuclear leukocytes and reactive oxygen metabolites have been indicated to have pivotal roles in the etiology.( - )

Skeletal muscle ischemia-reperfusion resulting from trauma, limb revascularization, orthopedic surgery, free flap reconstruction, or any other etiology not only leads to muscle damage itself but also causes injury involving a severe destruction of remote organs. Considerable advances have been made in the understanding of the mechanisms of this systemic response regarding the skeletal muscle ischemia-reperfusion sequence. Remote organs with intense microcapillary systems, such as the lungs, are prone to developing this type of systemic injury.( , )

Various investigators have demonstrated that the opioid pathway is involved in tissue preservation during hypoxia or ischemia, and this protection is mediated via the delta opioid receptor.( , ) Tramadol hydrochloride is an effective analgesic drug used for severe acute and chronic pain conditions. It has a weak affinity to the µ-opioid receptor and inhibits the reuptake of monoamines in the central nervous system, thereby activating the descending inhibitory systems.( , ) Recent research discloses that tramadol decreases lipid peroxidation and regulates noradrenalin uptake, and, therefore, these therapeutic properties are used for the management of myocardial ischemia.( )

The aim of the present study was to investigate the potential protective effect of tramadol hydrochloride on lung ischemia-reperfusion injury induced by the hind limb model by means of histopathological evaluation and determination of inflammatory responses via myeloperoxidase (MPO) activity and nitric oxide (NO) levels in the lung tissue of rats.

Methods

All of the animals used in the present research were properly cared in accordance with the norms of the Laboratory of Animal Experimentation at the Islamic Azad University Faculty of Specialized Veterinary Sciences, in Tehran, Iran. The study was approved by the Animal Research Ethics Committee of the Department of Veterinary Surgery of the university.

Twenty Wistar male rats, weighing 250-300 g (12-15 weeks old), were used in the present study. All of the rats were maintained under constant room temperature and standard conditions, with ad libitum access to water and commercial food, and placed in individual plastic cages with soft bedding. The animals were divided randomly into two experimental groups of ten rats each: ischemia-reperfusion (IR) group and ischemia-reperfusion + tramadol (IR+T) group. Anesthesia was induced using ketamine and xylazine (i.m., 50 mg/kg and 10 mg/kg, respectively). After induction of anesthesia, the left hind limb was completely clipped. After clipping, disinfecting, and dropping, a skin incision was made on the medial surface of the left hind limb. The femoral artery and vein were isolated from the surrounding tissues, and the femoral artery was exposed and clamped with a mini bulldog forceps. Prior to the occlusion of the femoral artery, 250 IU heparin was administered via the jugular vein in order to prevent clotting. All of the animals underwent 2-h ischemia by the occlusion femoral artery with a vascular clamp and 24-h reperfusion. The animals were maintained in dorsal recumbency and kept anesthetized throughout the duration of the ischemic period. Additional doses of the anesthetics were given as necessary in order to maintain anesthesia during the experiment. Body temperature was maintained with a heating pad under anesthesia. The animals in the IR+T group were administered tramadol i.v. (20 mg/kg)( ) immediately before reperfusion. Following the ischemic period, the vascular clamp was removed, and the surgical site was routinely closed. After the surgery, fluid losses were replaced by intraperitoneal administration of 5-mL warm isotonic saline, and the rats were returned to their cages with ad libitum access to commercial food and water during the reperfusion period. After 24 h of reperfusion, the rats were euthanized with an overdose of intraperitoneal pentobarbital injection (300 mg/kg), and the left lungs were harvested and fixed in 10% formaldehyde for histopathological examination under light microscopy. The right lungs were removed and stored at –20°C for analysis. The lung tissue homogenate and supernatant samples were prepared as described by Yildirim et al.( )

The biochemical assay consisted of determining MPO activity and NO levels in lung tissue. The activity of MPO( ) was analyzed spectrophotometrically as described elsewhere, whereas NO levels in lung tissue were measured by the Griess reaction.( )

All of the left lung tissue samples were fixed in 10% formalin solution and processed routinely (embedded in paraffin blocks, the anterior lung region being sectioned into 6-µm sections, and stained with H E). The severity of lung injury was determined by a pathologist who was blinded to the experiment. Lung injury was classified into four levels, as follows: level 0, no diagnostic change; level 1, mild neutrophil leukocyte infiltration and mild to moderate interstitial congestion; level 2, moderate neutrophil leukocyte infiltration, perivascular edema formation, and partial destruction of pulmonary architecture; and level 3, dense neutrophil leukocyte infiltration and complete destruction of pulmonary structure.( ) A total of four slides from each lung sample were randomly screened, and the mean level was considered representative of the sample.

Statistical analyses were carried out with the Statistical Package for the Social Sciences, version 11.2 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). The distribution of the groups was analyzed with one-sample Kolmogorov-Smirnov test. Biochemical results showed normal distribution, and one-way ANOVA was used. Histopathological results were analyzed using Kruskal-Wallis and Mann-Whitney U tests. Values of p < 0.05 were considered as statistically significant.

Results

All of the rats survived until the end of the study period.

Regarding biochemical results, NO levels were significantly higher in the lungs of the rats in the IR group than in those of the rats in the IR+T group (p = 0.001; Figure 1). Likewise, MPO activity, a novel indicator for neutrophil function, was significantly higher in the IR group than in the IR+T group (p = 0.001; Figure 2).

Figure 1

Levels of nitric oxide (NO) in lung tissue between the groups studied (p = 0.001).

Figure 2

Myeloperoxidase (MPO) activity in lung tissue between the groups studied (p = 0.001).

Figure 3 illustrates a representative photomicrograph of lung tissue of the rats in the IR group 24 h after reperfusion. Histological changes in the IR group included intra-alveolar edema, intra-alveolar hemorrhage, and neutrophil infiltration. The mean level of lung injury in the IR group was 2.10 ± 0.89. These pathological changes, particularly neutrophil infiltration, were much less common in the IR+T group (Figure 4). One animal in the IR+T group presented no injury, whereas the level of lung injury in the other animals ranged from 1 to 2 (mean, 1.70 ± 0.23). Histopathologically, there was a significant difference between two groups (p = 0.035).

Figure 3

Photomicrograph under light microscopy. Lung tissue of a rat in the ischemia-reperfusion group showing extensive intra-alveolar hemorrhage (HE; magnification, Ã-40).

Figure 4

Photomicrograph under light microscopy. Lung tissue of a rat in the ischemia-reperfusion + tramadol group showing fewer histological changes and better preserved, practically normal structures (HE; magnification, Ã-40).

Discussion

The lung is one of the most important target organs in multiple organ dysfunction syndrome or multiple system organ failure caused by severe injury. Lungs can be damaged by indirect injuries caused by the intestine, liver, and skeletal muscle reperfusion, as well as by circulatory shock.( , ) The mechanism of respiratory failure after ischemia-reperfusion injury is a complex process which is associated with the activation of systemic inflammatory mediators, including bacteriotoxins, immunocytokines, and inflammatory mediators, such as TNF and interleukins.( , ) TNF and NO are significant determinants of the lung injury process, which is caused by lower extremity ischemia-reperfusion,( , ) whereas MPO is an index for the accumulation of activated leukocytes in tissues and is associated with an overproduction of reactive oxygen species (ROS); therefore, leukocyte accumulation, high MPO activity, and excessive ROS production exist together in the inflammatory process. Overproduction of ROS results in a quick depletion of antioxidant capacity of the body, which consequently leads to the damage of target organs.( , )

Animal studies showed that opioids can act as a trigger for both phases of ischemic preconditioning,( ) and serotonin augments( ) or attenuates( ) this phenomenon depending on the concentration. Mayfield et al.( ) and Chien et al.( ) have demonstrated that the opioid pathway is involved in tissue preservation during hypoxia or ischemia. It has been proven that morphine has cardioprotective effects during ischemia-reperfusion.( , ) Factors such as respiratory depression and histamine release are the disadvantages of morphine usage during the postoperative period.( ) Tramadol is a centrally acting analgesic drug with negligible respiratory depressant action, very low tolerance, and physical dependence liability. The use of tramadol (10 and 20 mg/kg) showed a protective effect against transient forebrain ischemia in rats.( ) In the present study, we tested the hypothesis that 20 mg/kg of tramadol could protect the lungs from remote organ injury after skeletal muscle ischemia-reperfusion. Higher doses of tramadol should be investigated in order to determine whether higher doses would have a higher protective effect.

The present study, in concert with previous ones,( - ) confirmed that lower limb ischemia-reperfusion could induce acute lung injury in rats. We demonstrated that the acute lung injury induced by lower limb ischemia-reperfusion could be mitigated by tramadol. Our data demonstrate that tramadol significantly decreases the severity of acute lung injury, the infiltration of macrophages and polymorphonuclear leukocytes in the lungs, pulmonary vascular permeability, and intra-alveolar hemorrhage, as well as inhibiting cellular apoptosis in the lungs after skeletal muscle ischemia-reperfusion injury. These results suggest the possibility of clinical application of tramadol in ischemia-reperfusion injury of the lung. Different dosages, alternative time protocols, and forms of tramadol administration for lung injury induced by skeletal muscle ischemia-reperfusion should be investigated in future studies.

Introdução

A lesão de isquemia-reperfusão é um dos tipos mais comuns de lesão celular que ocorre em uma variedade de práticas cirúrgicas. A reperfusão de órgãos isquêmicos pode resultar em lesão tecidual, que se manifesta como disfunção celular microvascular e parenquimatosa. Os mecanismos subjacentes à lesão de isquemia-reperfusão já foram descritos; apontou-se que leucócitos polimorfonucleares e metabólitos reativos de oxigênio desempenham um papel fundamental na etiologia.( - )

A isquemia-reperfusão de músculo esquelético resultante de trauma, revascularização de membros, cirurgia ortopédica, reconstrução com retalho livre ou qualquer outra etiologia não só conduz a lesão muscular propriamente dita, mas também provoca lesões com grave destruição de órgãos remotos. Consideráveis avanços têm sido feitos na compreensão dos mecanismos dessa resposta sistêmica no tocante à sequência da isquemia-reperfusão de músculo esquelético. Órgãos remotos com sistemas microcapilares intensos, tais como os pulmões, são propensos a apresentar esse tipo de lesão sistêmica.( , )

Vários investigadores têm demonstrado que a via opioide está envolvida na preservação dos tecidos durante a hipóxia ou isquemia, e essa proteção é mediada pelo receptor opioide delta.( , ) O cloridrato de tramadol é um analgésico eficaz usado para condições graves de dor aguda e crônica. Há uma afinidade fraca entre o cloridrato de tramadol e o receptor opioide Î1/4, e aquele inibe a recaptação de monoaminas no sistema nervoso central, ativando assim os sistemas inibitórios descendentes.( , ) Um estudo recente revelou que o tramadol diminui a peroxidação lipídica e regula a captação de noradrenalina, e, por conseguinte, essas propriedades terapêuticas são usadas para o manejo da isquemia miocárdica.( )

O objetivo do presente estudo foi investigar o potencial efeito protetor do cloridrato de tramadol na lesão de isquemia-reperfusão pulmonar, induzida pelo modelo do membro posterior, por meio de avaliação histopatológica e determinação das respostas inflamatórias por via da atividade de mieloperoxidase (MPO) e dos níveis de óxido nítrico (NO) no tecido pulmonar de ratos.

Métodos

Todos os animais usados na presente pesquisa foram tratados de maneira apropriada, em conformidade com as normas do Laboratório de Experimentação Animal da Faculdade de Ciências Veterinárias Especializadas da Universidade Azad Islâmica, em Teerã, no Irã. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal do Departamento de Cirurgia Veterinária da universidade.

Vinte ratos Wistar machos pesando 250-300 g (com 12-15 semanas de idade) foram usados no presente estudo. Todos os ratos foram mantidos em temperatura ambiente constante e condições padronizadas, com água e ração comercial ad libitum, e colocados em gaiolas individuais de plástico com fundo macio. Os animais foram aleatoriamente divididos em dois grupos experimentais de dez animais cada: grupo isquemia-reperfusão (IR) e grupo isquemia-reperfusão + tramadol (IR+T). A anestesia foi induzida com cetamina e xilazina (i.m., 50 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente). Após a indução da anestesia, o membro posterior esquerdo foi completamente comprimido. Após termos comprimido, desinfetado e soltado o membro posterior esquerdo, fizemos uma incisão cutânea em sua superfície medial. A artéria femoral e a veia femoral foram isoladas dos tecidos circundantes, e a artéria femoral foi exposta e pinçada com uma minipinça buldogue. Antes da oclusão da artéria femoral, foram administrados 250 UI de heparina pela veia jugular, a fim de impedir a coagulação. Todos os animais foram submetidos a 2 h de isquemia (por meio da oclusão da artéria femoral com uma pinça vascular) e 24 h de reperfusão. Os animais foram mantidos em decúbito dorsal e permaneceram anestesiados ao longo de todo o período isquêmico. Doses adicionais dos anestésicos foram dadas conforme necessário a fim de manter a anestesia durante o experimento. A temperatura corporal foi mantida com uma almofada de aquecimento, sob anestesia. Os animais do grupo IR+T receberam tramadol i.v. (20 mg/kg)( ) imediatamente antes da reperfusão. Após o período isquêmico, a pinça vascular foi removida, e o sítio cirúrgico foi fechado de modo rotineiro. Após a cirurgia, as perdas de fluido foram repostas por meio de administração intraperitoneal de 5 mL de solução salina isotônica morna, e os ratos foram devolvidos a suas gaiolas, com ração comercial e água ad libitum durante o período de reperfusão. Após 24 horas de reperfusão, os ratos foram sacrificados por meio de injeção intraperitoneal de uma superdose de pentobarbital (300 mg/kg), e os pulmões esquerdos foram colhidos e fixados em formaldeído a 10% para exame histopatológico por meio de microscopia de luz. Os pulmões direitos foram removidos e armazenados a –20°C para análise. As amostras de tecido pulmonar homogeneizado e sobrenadante foram preparadas conforme descrito por Yildirim et al.( )

O ensaio bioquímico consistiu na determinação da atividade de MPO e dos níveis de NO no tecido pulmonar. A atividade de MPO( ) foi analisada espectrofotometricamente, conforme descrito anteriormente, ao passo que os níveis de NO no tecido pulmonar foram medidos por meio da reação de Griess.( )

Todas as amostras de tecido pulmonar esquerdo foram fixadas em solução de formalina a 10% e processadas de modo rotineiro (incluídas em blocos de parafina, com a região anterior do pulmão cortada em seções de 6 µm, e coradas com H E). A gravidade da lesão pulmonar foi determinada por um patologista que não estava ciente do experimento. A lesão pulmonar foi classificada em quatro níveis, a saber: nível 0, sem alteração diagnóstica; nível 1, leve infiltração de neutrófilos e congestão intersticial de leve a moderada; nível 2, moderada infiltração de neutrófilos, formação de edema perivascular e destruição parcial da arquitetura pulmonar; nível 3, densa infiltração de neutrófilos e destruição completa da estrutura pulmonar.( ) Quatro lâminas de cada amostra de pulmão foram avaliadas de forma aleatória, e o nível médio foi considerado representativo da amostra.

As análises estatísticas foram realizadas com o programa Statistical Package for the Social Sciences, versão 11.2 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). A distribuição dos grupos foi analisada por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov para uma amostra. Os resultados bioquímicos apresentaram distribuição normal, e a ANOVA de fator único foi usada. Os resultados histopatológicos foram analisados por meio do teste de Kruskal-Wallis e do teste U de Mann-Whitney. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

Resultados

Todos os ratos sobreviveram ao período de estudo.

No tocante aos resultados bioquímicos, os níveis de NO foram significativamente maiores nos pulmões dos ratos do grupo IR que nos dos ratos do grupo IR+T (p = 0,001; Figura 1). Do mesmo modo, a atividade de MPO, um novo indicador de função neutrofílica, foi significativamente maior no grupo IR que no grupo IR+T (p = 0,001; Figura 2).

Figura 1

Níveis de óxido nítrico (NO) no tecido pulmonar entre os grupos estudados (p = 0,001). IR: isquemia-reperfusão; e IR+T: isquemia-reperfusão + tramadol.

Figura 2

Atividade de mieloperoxidase (MPO) no tecido pulmonar entre os grupos estudados (p = 0,001). IR: isquemia-reperfusão; e IR+T: isquemia-reperfusão + tramadol.

A Figura 3 mostra uma fotomicrografia representativa do tecido pulmonar dos ratos do grupo IR 24 h após a reperfusão. As alterações histológicas no grupo IR incluíram edema intra-alveolar, hemorragia intra-alveolar, e infiltração de neutrófilos. O nível médio de lesão pulmonar no grupo IR foi de 2,10 ± 0,89. Essas alterações patológicas, particularmente a infiltração de neutrófilos, foram muito menos comuns no grupo IR+T (Figura 4). Um animal do grupo IR+T não apresentou lesão, ao passo que o nível de lesão pulmonar nos outros animais variou de 1 a 2 (média: 1,70 ± 0,23). Histopatologicamente, houve uma diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,035).

Figura 3

Fotomicrografia por microscopia de luz. Tecido pulmonar de um rato do grupo isquemia-reperfusão mostrando hemorragia intra-alveolar extensa (HE; aumento, 40Ã-).

Figura 4

Fotomicrografia por microscopia de luz. Tecido pulmonar de um rato do grupo isquemia-reperfusão + tramadol mostrando menos alterações histológicas e estruturas mais bem preservadas, praticamente normais (HE; aumento, 40Ã-).

Discussão

O pulmão é um dos órgãos-alvo mais importantes na síndrome de disfunção de múltiplos órgãos ou falência de múltiplos órgãos e sistemas causada por lesão grave. Os pulmões podem ser danificados por lesões indiretas causadas pela reperfusão do intestino, fígado e músculo esquelético, bem como por choque circulatório.( , ) O mecanismo de insuficiência respiratória após a lesão de isquemia-reperfusão é um processo complexo, que está associado à ativação de mediadores inflamatórios sistêmicos, incluindo toxinas bacterianas, imunocitocinas, e mediadores inflamatórios, tais como TNF e interleucinas.( , ) Tanto o TNF como o NO são determinantes importantes do processo de lesão pulmonar, que é causado por isquemia-reperfusão de membros inferiores,( , ) ao passo que a MPO é um índice para a acumulação de leucócitos ativados em tecidos e está associada à superprodução de espécies reativas de oxigênio (ERO); por conseguinte, a acumulação de leucócitos, a grande atividade de MPO e a produção excessiva de ERO coexistem no processo inflamatório. A superprodução de ERO resulta em rápida depleção da capacidade antioxidante do corpo, o que consequentemente leva à lesão de órgãos-alvo.( , )

Estudos com animais mostraram que os opioides podem agir como um gatilho para ambas as fases do pré-condicionamento isquêmico,( ) e a serotonina aumenta( ) ou atenua( ) esse fenômeno, dependendo da concentração. Mayfield et al.( ) e Chien et al.( ) demonstraram que a via opioide está envolvida na preservação dos tecidos durante a hipóxia ou isquemia. Provou-se que a morfina tem efeitos cardioprotetores durante a isquemia-reperfusão.( , ) Fatores como a depressão respiratória e a liberação de histamina são as desvantagens do uso de morfina no pós-operatório.( ) O tramadol é um analgésico de ação central com ação depressora respiratória insignificante, tolerância muito baixa e tendência a dependência física. O tramadol (10 e 20 mg/kg) teve efeito protetor contra isquemia transitória do prosencéfalo em ratos.( ) No presente estudo, testamos a hipótese de que 20 mg/kg de tramadol poderiam proteger os pulmões de lesões de órgãos remotos após a isquemia-reperfusão de músculo esquelético. Doses maiores de tramadol devem ser investigadas a fim de determinar se teriam um efeito protetor maior.

O presente estudo, em conformidade com estudos anteriores,( - ) confirmou que a isquemia-reperfusão de membros inferiores pode induzir lesão pulmonar aguda em ratos. Nós demonstramos que a lesão pulmonar aguda induzida por isquemia-reperfusão de membro inferior pode ser atenuada pelo tramadol. Nossos dados demonstram que o tramadol reduz significativamente a gravidade da lesão pulmonar aguda, a infiltração de macrófagos e leucócitos polimorfonucleares nos pulmões, a permeabilidade vascular pulmonar e a hemorragia intra-alveolar, além de inibir a apoptose celular nos pulmões após a lesão de isquemia-reperfusão de músculo esquelético. Esses resultados sugerem a possibilidade de aplicação clínica do tramadol na lesão de isquemia-reperfusão do pulmão. Estudos futuros devem investigar doses diferentes, protocolos de tempo alternativos e formas de administração do tramadol para lesão pulmonar induzida por isquemia-reperfusão de músculo esquelético.