[α-Enolase (ENO1) inhibits epithelial-mesenchymal transition in the A549 cell line by suppressing ERK1/2 phosphorylation].

BACKGROUND AND
OBJECTIVE: It has been proven that epithelial-mesenchymal transition (EMT) is a critical process which is precisely regulated by multiple signaling pathways during the progression and metastasis of non-small cell lung cancer (NSCLC). Canonical MAPK signaling is essential to transforming growth factor β (TGFβ)-induced EMT. Using the NSCLC cell line A549 as a model, the aim of this study is to explore the molecular mechanism of ENO1 affecting EMT.
METHODS: We established an A549 strain stably overexpressing ENO1. Cell mobility was measured by the wound-healing assay. EMT-related molecular alterations were detected by Western blot analysis. The effect of ENO1 on EMT was also detected by TGFβ-1-inducing assay. EGF-stimulating assay was performed to illustrate ERK1/2 phosphorylation changes resulting from ENO1 overexpression.
RESULTS: Overexpressed ENO1 inhibited the mobility of A549 (P<0.05), as well as the expression of the mesenchymal markers N-cadherin and vimentin, but upregulated the epithelial marker E-cadherin. TGFβ-inducing assay also showed that the negative effect of ENO1 on EMT. ERK1/2 phosphorylation was also obviously suppressed by ENO1 in the EGF-stimulating assay.
CONCLUSIONS: In NSCLC cells, ENO1 overexpression can inhibit EMT in vitro by suppressing ERK1/2 phosphorylation.

Elizabeth Hay于1968年提出上皮间质转换的概念，并指出这种转换在一定条件下是可以逆转的[。事实上，EMT过程在后生动物的整个生命周期中都起到重要作用，如发育、组织损伤修复、纤维化，以及某些病理过程（如恶性肿瘤的转移）[。最新的统计[显示，肺癌死亡率仍高居各类癌症之首。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）主要起源于上皮组织，因此大部分癌细胞维持上皮样特性，小部分细胞会通过EMT获得成纤维细胞样形态，失去胞间粘附并获得移动能力[。在分子水平上，这部分间质样细胞通常丢失E-钙粘蛋白（E-cadherin）、桥粒斑蛋白（Desmoplakin）和紧密连接蛋白（zonula occluden, ZO-1）等上皮样细胞表面分子，而获得间质样细胞标志如N-钙粘蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin），伴随着相关转录因子Twist、Snail和Slug的表达上调[。EMT是包含一系列精细复杂的变化，多种信号通路都参与其中，主要包括Wnt信号通路、TGFβ信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、磷脂酰肌醇激酶（phosphatidyl inositol 3-kinase, PI3K）信号通路、核因转录因子（nuclear factor-κB, NF-κB）信号通路和ERK信号通路等；此外，还有多种microRNA参与这一过程的调控，如miR-155、miR-200和miR-205[。

除了肺癌，在诸如结肠癌[、胃癌[和乳腺癌[等多种实体瘤的研究中，都发现发生EMT的肿瘤细胞具有更高的恶性程度。并且，原发灶的肿瘤细胞出现EMT，常常预示着较差的临床预后。一项针对EMT相关转录因子Slug的临床研究[发现，肺癌组织中其mRNA水平越高，患者的术后复发几率越高，生存期越短。

相比于正常组织，肿瘤组织即使在有氧条件下糖酵解过程也明显加强，并且相关酶类活性和表达水平都有所提高，即Warburg效应[。随后更多研究发现，糖酵解过程相关酶类如己糖激酶（hexokinase-2, HK-2）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase-A, LDH-A）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase, GAPDH）和ENO1，实际上是具有包括催化活性在内的多功能蛋白[。编码ENO1的mRNA可以通过选择性翻译，表达另一种短异构体c-Myc启动子结合蛋白1（c-Myc promoter binding protein-1, MBP-1）[。多种证据表明在乳腺癌[、NSCLC[、丙肝病毒相关肝细胞肝癌[、前列腺癌[和神经胶质瘤[中，ENO1和MBP-1都参与了癌症的发展过程。在人乳腺癌细胞MCF-7中过表达MBP-1，可以抑制细胞的侵袭能力[。在胃癌中，ENO1和MBP-1可以通过抑制环氧合酶（cyclooxygenase-2, COX-2）表达抑制细胞EMT过程，从而抑制细胞侵袭和转移能力[。目前，ENO1对肺癌细胞EMT的影响，没有明确阐述。

本研究旨在揭示ENO1对NSCLC细胞系A549的EMT过程的影响，及其潜在的分子机制。

材料与方法

野生型和突变型ENO1基因的克隆和真核表达质粒的构建

以人胚胎cDNA文库作为模板，利用LATaq聚合酶（Takara，日本）克隆野生型ENO1全长；并构建至pcDNATM3.1/myc-His(-)A载体（Invitrogen，美国）中。随后，利用PCR引入点突变的方法，将野生型ENO1第94和97位氨基酸对应密码子ATG突变为CTG。突变型ENO1m同样构建于pcDNATM3.1/myc-His(-)A载体中。目的片段序列测定由上海生工生物工程公司完成。

细胞培养、脂质体介导的细胞转染

人NSCLC细胞系A549（ATCC，美国），在含有10%胎牛血清的RPMI-1640（Invitrogen，美国）完全培养基中置于5%CO2、37 ℃条件下培养。当细胞融合度达到90%时进行质粒转染，按照LipofectamineTM2000（Invitrogen，美国）产品说明书操作。转染质粒24 h后，替换含终浓度为600 µg/mL G418的完全培养基中进行筛选，并维持选择压力，从而获得稳定过表达ENO1的细胞亚群，命名为A549-ENO1。对照组转染空载质粒，命名为A549-Ctrl。

划痕实验

当细胞融合度达到100%时，在培养皿中均匀划出三道划痕。磷酸盐缓冲液洗涤去除划下的细胞。加入含2%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于37 ℃、5%CO2条件下培养，此时记为第0天，并拍照记录。随后，每隔24 h更换含2%胎牛血清的培养基并拍照记录。

TGFβ-1诱导上皮间质转换实验

当细胞融合度在90%时，吸尽培养基，并用磷酸盐缓冲液洗涤。细胞经无血清培养饥饿24 h后，添加指定浓度TGFβ-1（R & D，美国）处理24 h，并拍照记录。

EGF刺激实验

当细胞融合度在50%-70%时，吸尽培养基，并用磷酸盐缓冲液洗涤。细胞经无血清培养基饥饿4 h后，加入终浓度为20 ng/mL的EGF（Cell Signal，美国）处理1 h。

细胞总蛋白的提取和Western blot分析

以适量含有1%苯甲基磺酰氟（PMSF）、1%蛋白酶抑制剂和1%磷酸酶抑制剂的RIPA蛋白裂解液（普利莱，中国）提取细胞总蛋白。采用BCA Protein Assay Kit（Thermo，美国）进行蛋白定量后用于Western blot分析。所用主要抗体及稀释比：ENO1（1:1, 500，奥维亚，中国）、ERK1/2（1:2, 000，Santa Cruz，美国）、p-ERK1/2（1:1, 000，Santa Cruz，美国）、p-MEK1/2（1:1, 000，Cell Signal，美国）、E-cadherin（1:1, 000，Santa Cruz，美国）、N-cadherin（1:1, 000，BD，美国）、Vimentin（1:500，Santa Cruz，美国）和β-actin（1:5, 000，Santa Cruz，美国）。

统计学分析

细胞划痕实验结果图采用ImageJ2X（National Institutes of Health）采集数据，SPSS Statistics 17.0进行两组独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

筛选稳定过表达ENO1的A549细胞

收集筛选后的A549-ENO1和对照A549-Ctrl总蛋白，进行Western blot检测。结果显示，相比于对照组，A549-ENO1的ENO1表达水平更高（图 1）。

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Western blot鉴定外源性ENO1基因在A549细胞中的过表达

The over-expression of exogenous ENO1 was examined by Western blot

过表达ENO1抑制细胞运动

划痕24 h、48 h和72 h后，A549-ENO1划痕仅愈合了19.6%、38.4%和63.4%，均低于对照组A549-Ctrl的34.5%、60.1%和85.9%（P < 0.05），表明ENO1过表达的A549细胞侧向运动能力明显下降（图 2A）。

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ENO1对A549细胞运动和EMT的抑制作用。A：划痕实验：在划痕后第24 h、48 h和72 h连续观察，过表达ENO1的A549细胞划痕恢复能力明显下降（*t检验，P < 0.05）。图表纵坐标表示划痕宽度相对0 h时划痕宽度比，横坐标表示时间；B：Western blot结果显示，相对于A549-Ctrl，A549-ENO1细胞中，E-cadherin表达明显增加，N-cadherin和Vimentin表达量明显降低；C：梯度TGFβ-1诱导EMT实验：低剂量（0.5 ng/mL）处理A549-Ctrl细胞即可出现大量间质样细胞，而A549-ENO1细胞需要较高剂量（2 ng/mL）处理才能出现一定数量的间质样细胞。

ENO1 inhibits A549 cell mobility and EMT process. A: Wound-healing assay: a continuous observation showed that over-expression of ENO1 resulted in limitation of A549 mobility (*t-test, P < 0.05). In the chart, Y-axis represents the relative wound width and X-axis represents time period; B: Western blot assay: compared to A549-Ctrl, E-cadherin up-regulated in A549-ENO1, with down-regulation of N-cadherin and Vimentin; C: gradient dose of TGFβ-1 inducing EMT: quantity of mesenchymal-like cells were obtained in A549-Ctrl population after low dose (0.5 ng/mL) of TGFβ-1 inducing. Relative lower ratio of mesenchymal-like cells formed in A549-ENO1 population after high dose (2 ng/mL) of TGFβ-1 treatment.

过表达ENO1抑制EMT过程

相比于对照组，A549-ENO1细胞中上皮样细胞标志物E-cadherin表达量明显上升，间质样细胞标志物N-cadherin和Vimentin的表达降低（图 2B）。TGFβ-1诱导EMT实验结果显示，较高浓度的TGFβ-1（2 ng/mL）处理24 h才能使A549-ENO1群体中出现较多的成纤维样细胞；对照组A549-Ctrl在低浓度TGFβ-1（0.5 ng/mL）处理24 h后即出现较多的成纤维样细胞（图 2C）。该结果说明ENO1过表达可以对TGFβ-1诱导A549细胞的EMT过程产生抑制效应。

ENO1抑制ERK磷酸化

相比于A549-Ctrl，A549-ENO1中磷酸化的ERK1/2水平明显下降（图 3A）。细胞血清饥饿4 h后，用终浓度为20 ng/mL的EGF同时处理1 h后发现，A549-ENO1细胞中磷酸化的ERK1/2明显低于对照组，而MEK1/2的磷酸化几乎不受影响（图 3B）。因此，我们推测ENO1可以通过抑制ERK1/2的磷酸化来抑制A549细胞的EMT。

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ENO1抑制A549细胞ERK1/2的磷酸化。A：同对照组相比A549-ENO1细胞中ERK1/2磷酸化水平明显受限；B：20 ng/mL的EGF处理细胞，A549-ENO1的ERK1/2磷酸化水平仍然明显低于对照组细胞，而MEK1/2磷酸化活化几乎不受影响。

ENO1 suppresses ERK1/2 phosphorylation in A549. Western blot result showed: A: Compared to A549-Ctrl group, ERK1/2 phosphorylation was inhibited by ENO1 over-expression; B: ERK1/2 phosphorylation level of A549-ENO1 was still lower than that of control group after EGF treatment, whereas MEK1/2 phosphorylation was almost not affected by ENO1 over-expression.

全长ENO1可以抑制EMT

野生型ENO1wt在第94和97位氨基酸残基对应的密码子是ATG，定点突变型ENO1m在对应位置为CTG（图 4A）。将野生型ENO1、突变型ENO1和空载质粒分别瞬时转染A549细胞48 h后，检测细胞中相关蛋白水平的变化，发现MBP-1表达没有明显的升高，并且突变型ENO1所产生的效应同野生型ENO1几乎完全相同（图 4B）。这表明全长ENO1蛋白可以阻碍EMT过程。

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野生型和点突变ENO1具有相同作用。A：序列比对发现ENO1突变型存在两个ATG→CTG；B：Western blot检测显示出瞬时过表达野生型和突变型ENO1对E-cadherin、N-cadherin、p-ERK1/2变化影响是相似的。

Wild type and point mutant ENO1 have the same effect. A: Sequence comparison: two point mutation ATG->CTG existed in mutant ENO1; B: Western blot assay: highly similar effect on E-cadherin, N-cadherin and p-ERK1/2 appeared after transient overexpression of wild type and mutant ENO1 in A549.

讨论

本实验室利用新型蛋白质组研究体系建立了肺癌相关分泌/释放蛋白数据库，其中包含了ENO1在内的糖酵解途径关键酶[；并且检测到在NSCLC患者和正常对照组外周血中，ENO1蛋白水平具有明显差异，因此，我们推测ENO1可能同NSCLC的发展具有密切联系[。本实验则针对ENO1在NSCLC细胞的EMT过程中的生物学功能进行了初步研究。

本研究在A549细胞系内稳定过表达ENO1，发现EMT相关分子标志物的改变和抑制ERK1/2磷酸化的现象，并导致A549细胞的运动能力下降。对比图 2C中未添加TGFβ-1处理的细胞，我们发现过表达ENO1会引起A549细胞形态更趋近于上皮样细胞的变化，而对照组细胞更多地呈现出间质样细胞的梭形特征。根据这些现象，我们提出了ENO1通过抑制ERK1/2磷酸化来抑制EMT的假设。随后的TGFβ-1诱导EMT实验和EGF刺激ERK1/2活化的实验，均证实了这个假设。

在糖酵解过程中的很多酶都是多功能性的蛋白[。ENO1在不同的组织细胞中不同的生理和病理状态下，甚至是在不同的细胞亚定位均能够显示出不同的功能[。Hsu等[发现细胞核中的ENO1/MBP-1可以作为转录因子降低COX-2的转录水平，抑制胃癌细胞的EMT。对ENO1在NSCLC中抑制EMT的作用仍然没有解释清楚。

本研究结果显示全长ENO1蛋白本身具有抑制EMT的效应。为了排除MBP-1的干扰，我们构建了在ATG密码子处不产生选择性翻译MBP-1的突变型ENO1，并检测到过表达野生型ENO1和突变型ENO1在蛋白水平上对EMT相关分子标志物的改变作用几乎完全相同。而MBP-1对ERK信号通路的影响，则需要进一步的实验验证。

本研究不仅初步证实了ENO1的多功能性，为“糖酵解相关酶是多功能蛋白”的理论提供了新证据，而且也从影响细胞内信号传导的角度揭示ENO1抑制EMT的分子机理。经典的MAPK通路涉及到了Raf1→MEK1/2→ERK1/2的信号传递和放大过程[，磷酸化的ERK1/2激活转录因子c-Jun和c-Fos表达，进而促进MMP-2等基因表达，降解胞外基质，促进细胞运动[。当细胞接受MEK1/2特异性抑制剂U0126处理后，ERK1/2信号通路被阻断，弱化TGFβ诱导EMT的效果，表明ERK1/2通路的活化是细胞EMT过程的一个必要条件[。ERK1/2的第204/187位酪氨酸残基和MEK1/2第218/222位丝氨酸残基的磷酸化，分别指示了这两种激酶的活化状态，并且MEK1/2是目前已知唯一能够活化ERK1/2的激酶[。基于这些条件，本实验分析了ENO1的过表达对ERK1/2信号通路的影响，进而发现了一个有趣的现象，即ENO1过表达引起活性状态的ERK1/2降低，而不影响MEK1/2活化。在另外一个研究[中，研究人员发现前列腺癌细胞中MBP-1可以通过同MEK5的直接相互作用抑制MEK5/BMK1的非经典MAPK信号通路。因此，我们推测在ERK1/2磷酸化/去磷酸化调节过程中，ENO1可能通过某种机制抑制了MEK1/2的催化活性，但不会影响MEK1/2的活化；也有可能是ENO1过表达，增强了PTPs和MKPs等磷酸酶活性，但这些推论需要更多的实验证据来支持。