[Expression and clinical relevance of uPA and ET-1 in non-small cell lung cancer].

BACKGROUND AND
OBJECTIVE: uPA and ET-1 proteins have been reported to be up-regulated in some of human cancers. The aim of this study is to investigate the alteration and clinical relevance of uPA and ET-1 protein levels in non-small cell lung cancer (NSCLC).
METHODS: Expressions of uPA and ET-1 protein were detected in 155 cases of NSCLC with tissue microarrays and immunohistochemistry (TMA-IHC) technique. The correlations between the alteration of the two proteins and clinicopathological parameters were analyzed.
RESULTS: Negative/weak, moderate and high expression of uPA were observed in 12.3%, 64.4% and 23.3% of squamous cell carcinomas, in 12.2%, 53.7% and 34.1% of adenocarcinomas, and in 12.3%, 58.7% and 29.0% of all cases. ET-1 presented negative/weak, moderate and high expression in 2.7%, 42.5% and 54.8% of squamous cell carcinomas, in 11.0%, 30.5% and 58.5% of adenocarcinomas, and in 7.1%, 36.1% and 56.8% of all cases. Simultaneously high expression of uPA and ET-1 were found in adenocarcinomas without lymph node metastasis (P=0.017). Adenocarcinoma patients with high expression of uPA or with high expression of both ET-1 and uPA had the longer survival time (P=0.007 and 0.016).
CONCLUSIONS: Detection of uPA and ET-1 protein levels might contribute to the prognosis evaluation of NSCLC.

肺癌是世界第一大恶性肿瘤，其发病率及死亡率居高不下，其中80%-85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC），预后较差。尽管临床术式和治疗方案不断改进，但肺癌的复发和转移使中晚期NSCLC患者的5年生存率很低。寻找可预测NSCLC患者复发和转移的分子标志物，可能有助于提高临床诊断的精准率，便于提前干预，降低该病的复发和转移。

肿瘤细胞通过血管等发生移位是癌症发生及转移的一个重要途径。尿激酶型血浆纤溶酶原激活因子（urokinase-type plasminogen activator, uPA）是一种重要的蛋白水解酶，可以把纤维蛋白溶酶原转化成纤维蛋白溶酶。uPA通过降解细胞外基质，促使细胞移动。文献[报道uPA蛋白在乳腺癌、宫颈癌和直肠癌等人类恶性肿瘤组织中表达上调。体外研究[表明uPA在促进肿瘤侵袭转移中起重要作用。

内皮素-1（endothelin-1, ET-1）是一种强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原，ET-1通过自分泌和旁分泌调节作用，促进细胞增殖、浸润以及血管的生成。ET-1蛋白水平在部分恶性肿瘤中是升高的，如膀胱癌[、结直肠癌[、前列腺癌[以及NSCLC[。卵巢癌的研究[显示ET-1能加快卵巢癌细胞的运动能力，增强肿瘤的侵袭性和转移。Boldrini等[报道具有高水平ET-1 mRNA的肺癌组织同时表现ET-1蛋白高表达。

本文通过组织微阵列联合免疫组织化学染色技术（tissue microarrays and immunohistochemistry, TMA-IHC）检测了155例非小细胞肺癌组织标本中的uPA和ET-1蛋白表达，进而分析了与临床、病理参数的相关性，以探讨其临床意义。

材料与方法

材料

共收集2006年7月-2009年7月中国医学科学院肿瘤医院胸外科肺癌手术标本155例。全部病例均由病理科诊断为NSCLC。其中，鳞癌73例，腺癌82例；男性110例，女性45例；年龄32岁-80岁，中位年龄60岁；肿瘤分期T2、T3、T4期分别为68例、53例和34例，有、无淋巴结转移各为112例和43例。其中有完整随访资料的病例为107例，死亡病例61例，平均随访时间为20个月（2个月-44个月）。

试剂

兔抗人uPA抗体（001098-R/R1，稀释浓度1:200）、兔抗人ET-1抗体（000202-R/R1，稀释浓度1:200）购于赛驰公司，PV-9000免疫组织化学试剂盒和DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

组织芯片制作

常规制作标本蜡块、切片。HE染色后经病理学专家复诊、定位标记。根据定位结果对石蜡块进行打点，每个病例用穿刺针取三个标记好的癌组织点，转移到芯片蜡块的相对应位置，对其进行切片。

免疫组化实验步骤

组织芯片常规脱蜡水化后，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶15 min，0.1%枸橼酸钠缓冲液中微波修复20 min，滴加一抗，4 ℃冰箱过夜，第二天依次加入试剂1和试剂2，在37 ℃下分别孵育20 min和30 min。DAB染色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜检。

结果判定

以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性信号，以阳性肿瘤细胞百分率和染色强度两方面分别进行半定量评分。染色强度评价方法：不着色为0分，浅棕黄色为1分，中度着色为2分，深棕黄色为3分。阳性肿瘤细胞百分率评价方法：无阳性细胞为0分，阳性肿瘤细胞数1%-33%为1分，阳性肿瘤细胞数34%-67%为2分，阳性肿瘤细胞数达到67%-100%为3分。染色强度和阳性细胞百分率得分相加记为综合分，0分-2分为阴性/弱阳性，3分-5分为中度阳性，6分为强阳性。

统计学分析

使用SPSS 15.0软件进行数据统计，采用双侧卡方检验方法分析蛋白表达改变与临床病理参数的相关性，Kaplan-Meier方法分析蛋白表达与患者术后生存之间的关系。P < 0.05为有统计学差异。

结果

uPA和ET-1在NSCLC组织中的表达情况

uPA阴性/弱阳性、中度阳性和强阳性表达在鳞癌中的比例各为12.3%、64.4%和23.3%，在腺癌中分别为12.2%、53.7%、34.1%，在全部病例分别为12.3%、58.7%、29.0%。ET-1在鳞癌中阴性/弱阳性、中度阳性和强阳性表达分别为2.7%、42.5%、54.8%，在腺癌中各为11.0%、30.5%、58.5%，在全部病例分别为7.1%、36.1%、56.8%（表 1，图 1，图 2）。

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155例NSCLC组织uPA和ET-1表达的免疫组化检测结果

The expression of uPA, ET-1 protein in 155 cases of NSCLC by immunohistochemistry

Protein	Score	SCC			ADC			All cases
		Cases (n=73)	Rate		Cases (n=82)	Rate		Cases (n=155)	Rate
SCC: squamous cell carcinoma; ADC: adenocarcinoma; NSCLC: non-small cell lung cancer.
uPA	0-2	9	12.3%		10	12.2%		19	12.3%
	3-5	47	64.4%		44	53.7%		91	58.7%
	6	17	23.3%		28	34.1%		45	29.0%
ET-1	0-2	2	2.7%		9	11.0%		11	7.1%
	3-5	31	42.5%		25	30.5%		56	36.1%
	6	40	54.8%		48	58.5%		88	56.8%

1

uPA在NSCLC中表达的免疫组化染色

The expression of uPA in NSCLC with immunohistochemistry. Left to right: negative/weak, moderate and high expression; A-F: squamous cell carcinoma; G-L: adenocarcinoma.

2

ET-1在NSCLC中表达的免疫组化染色

The expression of ET-1 in NSCLC with immunohistochemistry. Left to right: negative/weak, moderate and high expression; A-F: squamous cell carcinoma; G-L: adenocarcinoma.

uPA和ET-1表达与NSCLC患者临床病理参数的相关性

对uPA、ET-1表达与肿瘤组织的分期、区域淋巴结转移及分化程度进行相关性分析，结果显示单个蛋白在鳞癌的表达与以上临床病理参数均无关。uPA和ET-1同时高表达（强阳性）多见于无淋巴结转移的腺癌中（P=0.017）（表 2）。

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uPA和ET-1在腺癌中高表达与临床病理参数的关系

The relationship between uPA, ET-1 protein high xepression and clinicopathological parameters of adenocarcinoma

Clinicopathologic characteristic	n	uPA		P	ET-1		P	uPA and ET-1		P
		Positive	Rate		Positive	Rate		Positive	Rate
*3 cases of NX were not included.
TNM stage				0.754			0.940			0.649
T2	43	14	32.6%		25	58.1%		13	30.2%
T3	20	5	25.0%		9	45.5%		3	15.0%
T4	19	9	47.4%		14	70.0%		7	36.8%
Lymph node metastasis*				0.053			0.182			0.017
No	25	12	48.00%		17	68.0%		11	44.0%
Yes	54	12	22.2%		28	51.9%		10	18.5%
Differentiation				0.191			0.662			0.234
High	8	4	50.0%		5	62.5%		4	50.0%
Moderate	52	19	36.5%		31	57.4%		15	28.8%
Low	22	5	22.7%		12	54.5%		4	18.2%

uPA和ET-1蛋白表达与NSCLC患者术后生存时间的关系

经Kaplan-Meier分析，ET-1表达与NSCLC患者术后生存时间无关，uPA蛋白高表达或与ET-1同时高表达的腺癌患者具有较长的术后生存时间（P=0.007, P=0.016）（图 3，图4）。

3

uPA、ET-1表达与腺癌患者术后生存时间相关性的Kaplan-Meier分析

The Kaplan-Meier survival curves of adenocarcinoma patients with expressions of uPA and ET-1. A: uPA expression (P=0.007);B: Expression of both uPA and ET-1 (P=0.016).

讨论

恶性肿瘤由于其细胞生长、增殖失控等多因素、多层面的不确定因素，导致目前在临床上还没有一个很好的治疗办法。肺癌是威胁人类健康最主要的恶性肿瘤之一，其发病率及死亡率均居于癌症榜首。依靠传统的肺癌患者预后指标尚难把不同发病机制的患者区分开来。从分子水平寻找一些敏感性、特异性高的NSCLC相关分子标志物，可能为现有的预后指标提供重要补充。

uPA于1976年被Astedt等[在卵巢肿瘤细胞中发现。uPA以无活性的单链丝氨酸酶原形式由肿瘤细胞或其它细胞分泌，在细胞表面与uPAR（uPA的受体）结合后可被细胞表面的纤溶酶、舒血管素等激活。促进肿瘤细胞向受破坏的细胞外基质移动，引起肿瘤局部浸润性生长并进入脉管系统，进而发生远处转移[。本研究发现NSCLC组织中存在uPA蛋白高表达，与国内外在其它肿瘤中观察的uPA变化相符。Yang等[在结直肠癌研究中发现uPA蛋白升高与淋巴结转移无相关性（P > 0.05），也与本实验研究结果类似。Konecny等[报道uPA蛋白升高与卵巢癌患者较短的生存时间相关，而且可能作为一个独立的预后分子标志物。而本研究结果显示uPA蛋白高表达的肺腺癌患者却具有较长的生存时间，是否uPA在不同癌症中的作用有所差异，值得进一步研究。

内皮素（ET）家族中有三种异构体：ET-1、ET-2和ET-3，三者之间仅有2个-6个氨基酸不同，具有组织特异性[。人的ET-1基因全长12, 464 bp，含有5个外显子。ET-1是体内最强的缩血管活性肽，广泛存在于血管内皮细胞及神经细胞内，在很多肿瘤中都有过度表达。在肿瘤发生发展的过程中，血管生成是一个较早期事件。本研究发现ET-1蛋白在NSCLC组织中表达上调，与文献报道一致。刘玉春等[采用免疫组织化学方法检测发现，ET-1在NSCLC组织中的表达高于肺良性病变组织，尤其是在具有淋巴结转移阳性的肺癌组织中。我们并没有观察到ET-1与NSCLC的任何临床、病理参数存在相关性。但是，本研究的结果显示uPA和ET-1同时高表达多见于无淋巴结转移的腺癌中，而且uPA和ET-1同时高表达的腺癌患者具有较长的术后生存时间。这一结果也反映了肿瘤发生发展中的多基因异常，uPA和ET-1蛋白的联合检测可能有助于肺腺癌的预后判断。